Gelelektrophorese am Isas

Präsentation zum Thema: "Gelelektrophorese am Isas"—  Präsentation transkript:

1 Gelelektrophorese am Isas
SDS-Page 2D

2 SDS-PAGE Natrium – Dodecyl – Sulfat – Polyacrylamid Gelelektrophorese
Kontinuierliche PAGE Diskontinuierliche PAGE Durch SDS Proteine entfaltet, 1 Nettoladung proportional zur Molekülgröße

3 2D -PAGE Separation der Proteine nach 2 physikalischen Parametern
Auch orthogonale Seperation 1. Dim.: Separation durch isoelektrischen Punkt 2. Dim.: Separation nach elektrophoretischen Trennverfahren

4 Nachweißgrenze Molekülmasse Trennungskapazität Cells Proteine Peptide
Aminosäuren Trennungskapazität

5 Arbeitsschema für 2D-PAGE
1. Dimension ‚Probenbehälter‘ pH 3.0 IPG-strip pH 10.0

6 Proteine wandern im elektrischen Feld zu ihren isoelektrischen Punkt
 + -

7

8 1. Dimension IPG-Strips:
Im Handel erhältliche Gel-Streifen mit unmobilen und eingestellten pH-gradient (pH 3-10 )

9 Rehydratisierung ist nötig Für 24 cm Streifen sind 450 µL nötig
Vorbereitung da Streifen im Schiff transportiert wurden sind diese dehydratisiert (längere Lagerung) Rehydratisierung ist nötig Für 24 cm Streifen sind 450 µL nötig Mischung aus 8M Harnstoff 2M Thioharnstoff 2% CHAPS 0.002% Bromphenol blau 2% IPG-Puffer

10 Isoelektrische Fokusierung
Assembly of IEF-System Streifen in Vorrichtung (Streifenhalter) Elektroden an das Gel anschließen Proben aufs Gel/Streifen geben Streifen mit Öl abdecken Ungefähre Laufzeit 20h !!!!

11 Vorbereitung für 2 Dimension
Re-puffering von IPG-Streifen Reduktion and Alkylierung Schritt Streifen auf 2 Gel packen und laden Gel mit Agarose Lösung auffüllen, so dass Streifen gut aufliegt

12 2. Dimension Ungefähre Laufzeit 4h

13 Färbung Colloidal Coomassie (G-250) Silber Färbung 34% Methanol
2% Phosphorsäure 17% Ammoniumsulfat 0,066% Coomassie Silber Färbung