Quantifizierung von Tumorzellen in regionären Lymphknoten von Patienten mit Prostatakarzinom U. Fiedler, R. Kranz, A. Manseck, M. Wirth Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum der TU-Dresden

Metastasierung beim PCa Ausbreitung Lymphbahnen peripheres Blut Ansiedlung Lymphknoten 69 % Knochen 68% Lunge 48% Leber 33% Eble 1993

Diagnose der Lymphknoten- Metastasierung Prä-operativ: Tumormarkerbestimmung (PSA) Bildgebende Verfahren (MRT, PET) Post-operativ: Histopathologische Begutachtung Immunhistochemie

Molekularbiologischer Nach-weis der Lymphknoten-Metastasierung Nachweis und Quantifizierung prostataspezi- fischer Transkripte Prostata spezifisches Antigen (PSA) Transkripte: PSA mRNA Prostata spezifisches Membranantigen (PSM) Transkripte: PSM mRNA PSM‘ mRNA PSM‘‘ mRNA u. a.

Nachweis prostataspezifischer Transkripte mittels RT-PCR Aufschluß des Lymphknoten-Gewebes AAA AAA mRNA AAA Isolierung der Gesamt-RNA DNase-Behandlung Umschreibung in cDNA Transkript-spezifische PCR NNNNNN cDNA AAA PCR

Ergebnisse der qualitativen RT-PCR- Analysen n PSA+ PSM+ PSM‘+ PCa 54 12 51 32 PCa/N+ 17 12 16 15 PCa/N- 37 0 35 17 N+: histologisch positive Lymphknoten N-: keine Metastasierung festgestellt

Entwicklung der quantitativen RT-PCR-Analytik Bezugsgröße: GAPDH-Transkripte Standards: Plasmid-DNA mit klonierten PCR Produkten bekannter Konzentration für GAPDH, PSA, PSM, PSM‘ Analysen: Zweischritt-RT-PCR, Hybridisierungsproben, externe Standards Auswertung: Bestimmung einer durchschnittlichen GAPDH- Transkriptmenge pro µg Gesamt-RNA Angabe der prostataspezifischen Trans- kriptmengen pro µg Gesamt-RNA bei einheitlicher GAPDH-Menge

Ergebnisse der PSA-RT-PCR Analysen am Light-Cycler n PSA+ TK PCa/N+ 14 14/14 1,5x10E6 vb/PCa/N+ 3 3/3 7,2x10E4 PCa/N- 38 38/38 3,4x10E5 N+: histologisch positive Lymphknoten N-: keine Metastasierung festgestellt vb: hormonell behandelt TK: Transkriptmenge/µg RNA bei einheitlichem GAPDH

Ergebnisse der PSM-RT-PCR Analysen am Light-Cycler n PSM+ TK PCa/N+ 14 14/14 5,1x10E6 vb/PCa/N+ 3 3/3 1,0x10E6 PCa/N- 38 32/38 5,6x10E6 N+: histologisch positive Lymphknoten N-: keine Metastasierung festgestellt vb: hormonell behandelt TK: duchschnittliche Transkriptmenge/µg RNA bei einheitlichem GAPDH

Ergebnisse der PSM‘-RT-PCR Analysen am Light-Cycler n PSM‘+ TK PCa/N+ 14 9/14 6,5x10E6 vb/PCa/N+ 3 1/3 1,0x10E5 PCa/N- 38 9/38 1,9x10E7 N+: histologisch positive Lymphknoten N-: keine Metastasierung festgestellt vb: hormonell behandelt TK: Transkriptmenge/µg RNA bei einheitlichem GAPDH

Zusammenfassung Light-Cycler-Analysen ermöglichen: - spezifische Detektion von Transkripten - sensitive Detektion - Bestimmung der vorhandenen Zellmengen Bestimmung von Schwellwerten für die einzelnen Transkripte im follow up Einfluß auf die Überwachung/Therapie