Skm Marker Neg. Kon. Herz tor Herz nor LPL 310 603 872 PDK-4 Abb. 9: Agarose Gelelektrophorese. PDK-4 und LPL cDNA-Fragmente nach PCR- Amplifikation. Aus.

Präsentation zum Thema: "Skm Marker Neg. Kon. Herz tor Herz nor LPL 310 603 872 PDK-4 Abb. 9: Agarose Gelelektrophorese. PDK-4 und LPL cDNA-Fragmente nach PCR- Amplifikation. Aus."—  Präsentation transkript:

1 Skm Marker Neg. Kon. Herz tor Herz nor LPL 310 603 872 PDK-4 Abb. 9: Agarose Gelelektrophorese. PDK-4 und LPL cDNA-Fragmente nach PCR- Amplifikation. Aus der Auswahl der Primer ergibt sich für PDK-4 eine Fragmentgröße von 482 bp und für LPL von 498 bp. In der PCR wurde cDNA aus Skelettmuskelgewebe (Skm) normothermer Hamster und Herzmuskelgewebe von torpiden und normothermen Hamstern (Herz tor, Herz nor) eingesetzt.

2 Abb. 11: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 10. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 und den jeweiligen Actin Signalstärken (  SEM). RNA aus normothermen Gewebe (N): 0,45  0,06 (n = 7). RNA aus torpidem Gewebe (T): 0,57  0,13 (n = 5). T-Test für nicht verbundenen Stichproben: p= 0,38. a b c Abb. 10: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA nach Hybridisierung mit PDK-4 und Actin cDNA-Sonden. N: RNA aus Herzmuskelgewebe normothermer Hamster. T: RNA aus Herzmuskelgewebe torpider Hamster. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor dem Transfer der RNA auf die Nylonmembran. PDK-4 Actin Probe # 1T1T 2N2N 3N3N 4N4N 5N5N 12 N 11 T 10 T 9N9N 8N8N 7T7T 6T6T 28S rRNA 18S rRNA N/T

3 Abb. 13: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 12. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken (  SEM). Herz-RNA von Langtag- Hamstern: 1,6  0,44 (n = 11). Herz-RNA von torpiden und normothermen Kurztag- Hamstern: 1,98  0,79 (n = 11). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p= 0,89. Abb. 12: Obere Abbildung: Autoradiographie eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA pro Bahn von Langtag- und Kurztag-akklimatisierten Hamstern nach Hybridisierung mit der PDK-4 Sonde. Untere Abbildung: Photo des dazugehörigen Northerngels vor dem Transfer der RNA auf die Nylonmembran. Proben# 12345764N4N 5N5N 6T6T 7T7T 8N8N 10 T 9N9N 8910111T1T 3N3N 2N2N T N/T LangtagKurztag PDK-4 28S rRNA 18S rRNA

4 Abb. 14 : Für die Klonierung differentieller Sequenzen ausgeschnittene Banden. N-DP2: Zweites Differenzprodukt der Analyse mit normotherm-cDNA als Tester. T- DP2: Zweites Differenzprodukt der Analyse mit torpid-cDNA als Tester. 300 400 500 200 Marker T3 T2 T1 T4 T-DP2 N2 N3 N1 N-DP2

5 Abb. 16: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Southernblots aus Abb. 15. Die Anreicherung des im N-Amplicon in höherer Konzentration vorhandenen N2/9 cDNA ist als Zunahme der Signalintensitäten nach densitometrischer Messung dargestellt. Abb. 15: Autoradiographie eines Southernblots nach Hybridisierung mit cDNA des Klons N2/9. Die N2/9 cDNA wurde aus dem zweiten Normotherm-Differenzprodukt (N-DP 2) isoliert. Der Unterschied in der Konzentration der N2/9 cDNA in den Amplicons (AMP) für Normothermie und Torpor (N, T) führte zu einer Anreicherung der Sequenz im ersten und zweiten N-Differenzprodukt (DP1, DP2). N T N T N T AMPDP2DP1

6 N T AMP N T DP2 N T DP1 Abb. 17: Autoradiographie eines Southernblots nach Hybridisierung mit cDNA des Klons T2/6. Die T2/6 cDNA wurde aus dem zweiten Torpid-Differenzprodukt (T-DP 2) isoliert. Der Unterschied in der Konzentration der T2/6 cDNA in den Amplicons (AMP) für Normothermie und Torpor (N, T) führte zu einer Anreicherung der Sequenz im ersten und zweiten T-Differenzprodukt (DP1, DP2). Abb. 18: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Southernblots aus Abb. 17. Klon T2/6 war im T-Amplicon etwa 50% stärker repräsentiert. Eine deutliche Anreicherung erfolgte im zweiten T-Differenzprodukt.

7 N T T4/6T2/6N3/11 Abb. 19: Mittels Phosphor Imager Screen detektierte Dotblot-Signale. Obere Reihe: Nach Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten Amplicon der normotherm-cDNA. Untere Reihe: Nach Hybridisierung mit dem radioktiv markiertem Amplicon der torpid-cDNA. Klon T4/6: Signal 20% intensiver nach Hybridisierung mit den T- Amplicon. Klon T2/6: Signal 40% intensiver nach Hybridisierung mit dem T- Amplicon. Klon N3/11: Ausschließlich nach Hybridisierung mit dem N-Amplicon detektierbar.

8 Abb. 21: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Northernblots nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T3/4. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den T3/4 und den jeweiligen 28S rRNA (Gelphoto) Signalstärken (  SEM). Normotherm: 1,36  0,41 (n=7). Torpid: 1,4  0,14 (n=5). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p=0,39. Abb. 20: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 30 µg Herz-RNA von torpiden (T) und normothermen Hamstern (N) nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T3/4 und Actin. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor dem Transfer der RNA auf die Nylonmembran. a b c Probe # 1T1T 2N2N 3N3N 4N4N 5N5N 12 N 11 T 10 T 9N9N 8N8N 7T7T 6T6T Actin 18S rRNA 28S rRNA T3/4 N/T

9 * Abb. 23: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Northernblots nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T2/6. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den T2/6 und den jeweiligen 28S rRNA (Gelphoto) Signalstärken (  SEM). Normotherm: 1,33  0,02 (n=7). Torpid: 1,8  0,11 (n=5). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p=0,0142. Abb. 22: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 30 µg Herz-RNA von torpiden (T) und normothermen Hamstern (N) nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T2/6 und Actin. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor Transfer der RNA auf die Nylonmembran. T2/6 Probe # 1T1T 2N2N 3N3N 4N4N 5N5N 12 N 11 T 10 T 9N9N 8N8N 7T7T 6T6T Actin 18S rRNA 28S rRNA a b c N/T

10 Abb. : 20 µg Herz-RNA Hybrid. mit N2/9 Probe # 1T1T 2N2N 3N3N 4N4N 5N5N 12 N 11 T 10 T 9N9N 8N8N 7T7T 6T6T N2/9

11 Abb. 11: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie aus Abb. 10. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 Signalstärken auf der Autoradiographie und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken des Gelphotos (+/- SEM). RNA aus normothermen Gewebe (N): 0,78 +/- 0,09 (n = 7). RNA aus torpidem Gewebe (T): 0,94 +/- 0,13 (n = 5). T-Test für nicht verbundenen Stichproben: p= 0,304. Abb. 10: Autoradiographie eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA nach Hybridisierung mit PDK-4 und Actin cDNA. N: RNA aus Herzmuskelgewebe normothermer Hamster. T: RNA aus Herzmuskelgewebe aus Gewebe torpider Hamster. PDK-4 Actin Probe # 1T1T 2N2N 3N3N 4N4N 5N5N 12 N 11 T 10 T 9N9N 8N8N 7T7T 6T6T 28S rRNA 18S rRNA a b c

12 Proben # 12345764N4N 5N5N 6T6T 7T7T 8N8N 10 T 9N9N 8910111T1T 3N3N 2N2N T N/T LangtagKurztag Abb. 12: Autradiographien eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA pro Bahn von Langtag- und Kurztag-akklimatisierten Hamstern nach Hybridisierung mit der PDK-4 Sonde und 28S rRNA Sonde. PDK-4 28S rRNA Abb. 13: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 12. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken (+/- SEM). Herz-RNA von Langtag- Hamstern: 0,38 +/- 0,01 (n = 11). Herz-RNA von torpiden und normothermen Kurztag-Hamstern: 0,39 +/- 0,1 (n = 11). T-Test für nicht verbundenen Stichproben: p= 0,84.