Projekttreffen Jena Teilprojekt 3 Friedrich-Schiller-Universität Jena Institut für Ernährungswissenschaften Lehrstuhl Ernährungsphysiologie

Auftrennung der Lipidklassen mittels DC und Densitometrie Quantitative Messung der Tonwerte pro Flächeneinheit Bestimmung der prozentualen Anteile der Lipidklassen einer Probe Alternative zum internen Standard der Gaschromatografie

Densitometrie - Methode 1. Auftragen von Standards und Proben 2. Auftrennung der Lipidklassen 3. Färbung/Fixierung

Densitometrie - Methode 3. Gefärbte HPTLC-Platte 4. Scanner 1:641:161:21:321:81:1 Standards D0 10µL D50 10µL D100 10µL D0 20µL D50 20µL D100 20µL Darmsäfte CE FAME TAG FFS Chol PL

Densitometrie - Ergebnisse KlasseBahn 7Bahn 8Bahn 9Bahn 10Bahn 11Bahn 12 PL Chol FFS TAG FAME CE KlassemnD0 10µLD0 20µLD50 10µLD50 20µLD100 10µLD100 20µL PL Chol FFS TAG FAME CE Klassen in %D0 10µLD0 20µLD50 10µLD50 20µLD100 10µLD100 20µL Freies Cholesterin Freie Fettsäuren Triacylglyceride Fettsäuremethylester Cholesterolester

Densitometrie - Ergebnisse Durchschnittliche Molare Masse der FS: Molare Masse von Glycerol:92.10 Molare Masse von Wasser:18.02 Durchschnittliche Molare Masse des TAG: Glycerinanteil [%]: FFS [%]63.95 FS aus TAG [%] FS aus FAME [%]2.86 FS aus CE [%] Summe: Faktor:0.931

Genexpression Frage:Hat eine CLA-Supplementation Einfluss auf die Expression bestimmter Kandidatengene? Welche Gene sind von Interesse? Wie wird die Genexpressionsanalyse realisiert? Was kann man aus den Daten ableiten?

Micro-Array - Layout Spot IDNAME 1 ACAA1_33 2ACAA2_34 3 ACACA_35 4ACACB_36 5 ACADL_37 6ACADM_38 7 ACADSB_89 8ACADS_39 9 ACADVL_90 10ACSL1_40 11 ACSL4_41 12ACSS1_42 13 ACSS2_43 14ACTB_10 15 ADIPOR1_86 16ADIPOR2_87 19 AGPAT1_91 20AGPAT2_92 21 AGPAT3_93 22AGPAT4_94 23 AGPAT5_95 24AGPAT6_96 25 CEBPA_44 26CEBPB_45 27 CEBPD_46 30CEBPE_47 31 CEBPG_48 34CEBPZ_49 35 CPT1A_50 36CPT1B_51 37 CPT2_11 38DCI_2 39 DGAT1_52 40DGAT2_53 Spot IDNAME 41 ECH1_12 42ECHS1_54 45 EHHADH_19 46ELOVL1_23 47 ELOVL2_24 48ELOVL3_25 49 ELOVL4_26 50ELOVL5_27 51 ELOVL6_28 52ELOVL7_29 53 FABP1_55 54FABP2_56 55 FABP3_57 56FABP4_58 57 FADS1_59 58FADS2_60 59 FASN_13 60FFAR2_61 61 FFAR3_62 62GAPDH_63 63 GPAM_15 64HADH_14 65 HP_1 66IL6_3 67 INSIG1_30 68INSIG2_31 69 LEPR_16 70LEP_4 71 LIPE_17 72LPIN1_64 73 LPIN2_65 74LPIN3_66 75 LPL_5 76MCAT_18 Spot IDNAME 77 MLXIPL_77 78MLX_6 79 NR1H2_67 80NR1H3_68 81 PLA2G2D1_82 82PLA2G2D3_83 83 PLA2G2D4_84 84PLA2G2D5_85 85 PLA2G4A_88 86PLCB1_69 87 PLCB3_70 88POR_7 89 PPARA_71 90PPARD_72 91 PPARG_73 92PTGS1_74 93 PTGS2_75 94SCAP_20 95 SCD5_21 96SCD_8 97 SLC25A20_32 98SLC27A6_78 99 SLC2A4_79 100SREBF1_ SREBF2_81 102THRSP_ TNF_9 104UCP1_22

Vorgehensweise 1.RNA-Extraktion aus Geweben (Leber & Euter) 2.cDNA-Synthese 3.Hybridisierung (Micro-Array) 4.Analyse und Auswertung

RNA-Extraktion Homogenisierung 3 min bei max Geschw. Überstand auf gDNA Eliminator Säule 30 s bei RT und 8000 x g 70%igen EtOH zugeben/mischen max. 700 µL Probe auf RNA-Säule 15 s bei RT und 8000 x g Waschen mit 700 µL RW1-Puffer 15 s bei RT und 8000 x g 2 x Waschen mit 500 µL RPE-Puffer 2 min bei RT und 8000 x g 20 µL RNase freies Wasser (70-80°C) direkt auf Membran 10 min bei RT stehen lassen 1 min bei RT und 8000 x g mit weiteren 10 µL wiederholen Konzentrationsbestimmung

cDNA-Synthese KomponenteEndkonzentration Gesamt-RNA1,5 µg Primer20-50 pmol Bidest KomponenteEndkonzentration 5-fach Expand RT-Puffer1-fach DTT (100 mM)10 mM PCR dNTPs (5 mM dACGTP, 2 mM dTTP) 120 µM dACGTP, 50 µM dTTP Expand RT (50 U/µL)75 U U Biotin-16-dUTP(1 mM)50 µM Denaturieren der RNA und des Primers (10 min bei 65°C) sofort auf Eis abkühlen 1 M NaOH 10 min bei 65°C inkubieren 1 M HCl zur Neutralisation Reinigung der cDNA 10 min bei RT 50 min bei 42°C Erneute Zugabe von Reverser Transkriptase 60 min bei 42°C

Micro-Array - Funktionsweise  Basis bildet ein Mikroreaktionsgefäss  Glasträger (3x3 mm) im Boden integriert  Glasträger ist mit 15x15 Spots gefertigt Biotinmarken Referenzpunkte

Micro-Array - Funktionsweise  nicht-radioaktive Markierung der cDNA mit Biotin  Hybridisierung der cDNA mit den Sequenzen auf dem Glasträger (1 h bei 55°C und 550 rpm)  Konjugation des Biotins mit Streptavidin/HRP (10 min bei 30°C und 550 rpm)

Micro-Array - Funktionsweise  Substrat TMB (Tetramethylbenzidin) wird durch HRP (horseradish peroxidase) umgesetzt  5 min bei RT  Bildung eines blau-grünen Präzipitats  Detektion innerhalb der nächsten 20 min  Analyse erfolgt über spezielle Software

Micro-Array – Erste Ergebnisse E620 E640E641E647 E669 Euter – K105

Euter – CLA105 Micro-Array – Erste Ergebnisse E617 E630E638E644 E653 E655

Micro-Array – Erste Ergebnisse (n=5) Euter – Kontrolle 105 vs. CLA 105