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Chimeric Cytochromes P450 Engineered by Domain Swapping and Random Mutagenesis for Producing Human Metabolites of Drug Ji-Yoen Kang et al. Julia Majer.

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Präsentation zum Thema: "Chimeric Cytochromes P450 Engineered by Domain Swapping and Random Mutagenesis for Producing Human Metabolites of Drug Ji-Yoen Kang et al. Julia Majer."—  Präsentation transkript:

1 Chimeric Cytochromes P450 Engineered by Domain Swapping and Random Mutagenesis for Producing Human Metabolites of Drug Ji-Yoen Kang et al. Julia Majer

2 Enzymfamilie der Cytochrom P450 (CYPs) Hämproteine = Häme, als prosthetische Gruppe & Eisen-Ion als Zentralatom Ubiquitäres Vorkommen 57 verschiedene CYPs beim Menschen Lokalisation v.a. in der Leber (Inneren ER) Beteiligung an ca. 75 % aller metabolischen Reaktionen der auf dem Markt vorhandenen Arzneistoffe (Substanz → aktiven Metabolit → Wirkung) Substarte = körpereigene (Fett-, Gallensäure, Steroide) oder körperfremde Stoffe (Arzneimittel) Klasse: Oxidoreduktasen, genauer Monooxygenasen → wichtigste Reaktion: Hydroxylierung Übertragen Sauerstoffatom des Sauerstoffmoleküls auf ein Substrat → R–H + O 2 + NADPH + H + → R–OH + H 2 O + NADP + → Reduktionsmittel: NADH/NADPH, Flavin/Flavoproteine oder Ferredoxin 2 Einleitung

3 P450 BM3 (CYP102A1) Bacillus megaterium 1982 von Fulco‘s Group UCLA identifiziert Nicht membrangebunden Identisch zur eukaryotischen CYP4A Familie (hydroxylieren Fettsäuren) Natürliche Substrate: langkettige Fettsäuren (C 12 bis C 20 ) Besteht aus Häm(-Oxygenase)domäne (HämD) sowie den beiden C-terminalen Flavinadenindinukleotid- und Flavinmononukleotid-Domänen mit der NADPH - P450 Reduktase (ReduktaseD) Höchste katalytische Aktivität bei P450 Monooxygenasen 3 Einleitung

4 P450 BM3 Struktur 4 3D Struktur AW Munro et al., P450 BM3: the very model of a modern flavocytochrome null, Volume 27, Issue 5, 2002, 250–257, Bedeutung der FMN Domäne -Transportiert Flavin Cofaktor von FAD zur P450 Häme Domäne -Transportiert durch NADPH Oxidation hergestellte Elektronen -Erleichterte Bewegung (10 Ᾰ ) durch Linkerregion Hydroxylierung am Eisen-Ion mittels Sauerstoff Einleitung

5 Ziel der Studie: Mögliche Rolle der ReduktaseD in Bezug auf die katalytische Aktivität der HämD „Domain Swapping“ der ReduktaseD von zwei CYP102A1 Mutanten: 1.) katalytisch hoch aktiven CYP102A1 HämD Mutanten (M13, M15, M16 und M17), zeigen hohe Aktivitäten gegenüber Lovastatin, 7-EC und Phenacetin 2.) CYP102A1.2 (=V2) natürliche Variante mit 20 Mutationen in der ReduktaseD, d.h. hohe Aktivität gegenüber Reduktase Substarten (z.B. Ferricyanide und Cytochrome C) Herstellung Mutanten durch direkte Evolution und Rationales Design Expression in E. coli DH5αF‘-IQ Zellen 5 Vorgehensweise

6 6 CYP102A1.2 (V2) mit 20 Mutationen in der ReduktaseD Hoch aktive CYP102A1 Mutanten (*HämD) Durch die Kombination der beiden Domänen wurden Chimäras erzeugt → „Domain Swapping“ Mittels Aktivität Assays gegenüber verschiedenen humanen P450 Substarten wurden Chimäras ausgewählt CYP102A1 Chimära (M13V2, M15V2, M16V2 & M17V2) CYP102A1 chimäre Mutanten von M16V2 Anlegen von Bibliotheken der Chimäras Random Mutagenesis mittels Error-Prone PCR an der HämD → Klonierung der amplifizierten Fragmente in Vektor → Transformation in E. coli DH5αF‘-IQ Zellen Vorgehensweise

7 7 CYP102A1 chimäre Mutanten von M16V2 Whole-cell Assay → High Throughput Screening E. coli Zellen durchlaufen mehrere Wasch- und Inkubationsschritte in 96-Wellplatten Zugabe von p-Nitrophenol als Substrat & NADPH Regenerierungssytem Signal wird als Änderung der Farbintensität bei 510 nm gemessen (Microplate Reader) → Selektion von 19 Mutanten höchster Aktivität Katalytische Aktivität Assays → HPLC → Selektion der Mutanten höchster Aktivität 1.Typische humane P450 Substrate & Statine 2.HMG-CoA Reduktase Inhibitionsassay 3.Fettsäure Hydroxylierung Vorgehensweise

8 8 Ergebnisse Acetaminophen (O-Deethylierung) 2-fach höhere Aktivität der M16V2 Mutanten Schmerzbehandlung & Fiebersenkung Fluorogenes Substrat Muskelkrämpfen Intermediat in der Synthese von Paracetamol *7-EFC = 7-Ethoxy-4-Trifluoromethylcoumarin *

9 1b.Katalytische Aktivität Assays mittels Statine Zur Behandlung von Hyperlipidämie, genauer Hypercholesterinämie eingesetzt Sinken Cholesterinspiegel im Blut: Statin 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzym A (HMG CoA) Mevalonsäure Cholesterin werden von humanen CYP3A4 oxidiert 9 HMG CoA- Reduktase Simvastatin Lovastatin Fluvastatin Atorvastatin Ergebnisse

10 10 1b.Katalytische Aktivität Assays mittels Statine Identisch 6‘β-OH Statine Chimäre Mutanten zeigen alle hohe Aktivitäten Vgl.: beim humanen CYP3A4 liegt TTN von Simvastatin bei 8,3/min 4-OH Atorvastatin G1 und M17V2 höchste Aktivität Viele zeigen kaum Aktivität Ergebnisse WT zeigt keine Aktivität

11 11 1b.Bestimmung kinetischer Parameter mittels Statine Ergebnisse SubstratEnzyme SimvastatinM G LovastatinM G FluvastatinM G AtorvastatinM G → Mittels TTN und Michaeliskonstante wurde die katalytische Effizienz der Enzyme bestimmt

12 12 2.HMG CoA-Reduktase Inhibitionsassay Statine hemmen die HMG CoA-Reduktase Hydroxylierte Metabolite zeigen vergleichbare inhibitorische Wirkung Simvastatin6‘ß-OHLovastatin6‘ß-OHFluvastatin5-/6-OHAtorvastatin4-OH Konzentration6 µM 1 µM Reduktase Aktivität 75 %50 %55 %50 % 55 %15 %50 % Ergebnisse

13 13 3.Fettsäure Hydroxylierung (GC) Hydroxylierung von CYP102A1 am ω-1, ω-2 und ω-3 Kohlenstoff → M15V2 höchsten Hydroxylierungs Aktivitäten bei Laurinsäure → M13V2 höchsten Hydroxylierungs Aktivitäten bei Myristin- und Palmitinsäure → Alle M16V2 Mutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp niedrige Aktivitäten Ergebnisse Laurinsäure (Dodecansäure) Kokosfett, Lorbeerfrucht Myristinsäure (Tetradecansäure) Muskatnussbutter, tierischen Fetten Palmitinsäure (Hexadecansäure) Palmöl, Rindertalg

14 Domain Swapping war in einigen Fällen nützlich, um erhöhte Enzymaktivitäten hervorzurufe ReduktaseD ist essentiell für die katalytische Aktivität der CYP102A1 HämD WT zeigte kaum katalytische Aktivitäten G1 und H1 zeigten von den 19 chimären Mutanten die höchsten Enzymaktivitäten Mögliche Perspektiven der veränderten Cytochrome P450 Enzyme: Einsatz als industrielle Biokatalysatoren zur Produktion von Arzneistoffen & Metaboliten Statin Metabolite zur Behandlung von Störungen des Lipoproteinstoffwechsels 14 Zusammenfassung

15 15 Fura A Role of pharmacologically active metabolites in drug discovery and development. Drug Discov Today 11:133–142. Guengerich FP Cytochrome P450 enzymes in the generation of commercial products. Nat Rev Drug Discov 1:359–366. Guengerich FP Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. AAPS J 8:E101–E111. Guengerich FP Introduction: Human metabolites in safety testing (MIST) issue. Chem Res Toxicol 22:237–238. Kang JY, Kim SY, KimD, Kim DH, Shin SM, Park SH, Kim KH, Jung HC, PanJG, Joung YH, Chi YT, Chae HZ, Ahn T, Yun CH Characterization of diverse natural variants of CYP102A1 found within a species of Bacillus megaterium. AMB Express 1:1 Landwehr M, Carbone M, Otey CR, Li Y, Arnold FH Diversification of catalytic function in a synthetic family of chimeric cytochrome P450s. Chem Biol 14:269–278. Munro AW, Leys DG, McLean KJ, Marshall KR, Ost TW, Daff S, Miles CS, Chapman SK, Lysek DA, Moser CC, Page CC, Dutton PL P450 BM3: The very model of a modern flavocytochrome. Trends Biochem Sci 27:250–257. Otey CR, Landwehr M, Endelman JB, Hiraga K, Bloom JD, Arnold FH Structure-guided recombination creates an artificial family of cytochromes P450. PLoS Biol 4:e112.


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