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Biotransformation of the sesquiterpene (+)-valencene by cytochrome P450cam and P450BM-3 Rebecca J. Sowden, Samina Yasmin, Nicholas H. Rees, Stephen G.

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Präsentation zum Thema: "Biotransformation of the sesquiterpene (+)-valencene by cytochrome P450cam and P450BM-3 Rebecca J. Sowden, Samina Yasmin, Nicholas H. Rees, Stephen G."—  Präsentation transkript:

1 Biotransformation of the sesquiterpene (+)-valencene by cytochrome P450cam and P450BM-3 Rebecca J. Sowden, Samina Yasmin, Nicholas H. Rees, Stephen G. Bell and Luet-Lok Wong* Department of Chemistry, Inorganic Chemistry Laboratory, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, UK Received 25th August 2004, Accepted 11th October 2004 First published as an Advance Article on the web 18th November 2004

2 Gewünschte Umsetzung: aus Orangenöl Synthasegen in E.coli exprimiert aus Grapefruitsaft gefragter Duftstoff billig teuer

3 Ansatz: Biologische Oxidation von (+)-Valencene mit P450 Monooxygenase zu (+)-Nootkatone Probleme: (+)-Valencene kein Substrat für Wildtyp P450 (+)-Nootkatone inhibiert P450 Neben (+)-Nootkatone entstehen auch andere Produkte Verwendung von Enzymen mit Punktmutationen

4 Verwendete Enzyme: Cytochrom P450 cam Cytochrom P450 BM-3 aus Pseudomonas putida Substrat: Campher gut charakterisiert aus Bacillus megaterium Substrat: mittel- bis langkettige Fettsäuren gut charakterisiert

5 Verwendete Mutationen bei P450 cam : F87A: kleinere AS Y96F: hydrophobere AS V247L: schließt Substrattasche L244A: schafft Platz am Häm Die Versuche wurden in vitro durchgeführt

6 Ergebnisse für P450 Cam Bei natürlichem Substrat Campher: - Rate 1000min -1 - Ausbeute > 95%

7 Ergebnisse für P450 cam : Mutanten haben niedrige Aktivität für (+)-Valencene verglichen mit Campher Aber hohe Regioselektivität für C 2 -Oxidation F87A/Y96F/L244A Mutante erzeugt hohen Anteil an Nootkatone F87A/Y96F/L244A/V247L Mutante hat hohe Selektivität für (+)-trans- nootkatol: Eventuell Umsetzung zu Nootkatone mit Dehydrogenase bei gleichzeitiger Regeneration von NADH möglich?

8 Verwendete Mutationen bei P450 BM-3 : R47L: kleiner und unpolar Y51F: unpolare AS F87A: kleinere AS I263A: kleinere AS

9 Durchführung: In vivo Ansatz in E.coli zur Produktbildung und –isolation Problem: Produkte sind toxisch für Mikroorganismen Zugabe von 2% v/v n-Hexadecan Produkte gehen in organische Phase Trennung der Produkte per Säulenchromatographie Analyse per Gaschromatographie

10 Ergebnisse für P450 BM-3 : Große Anzahl an weiteren Produkten erhalten Aktivität bei Fettsäuren: ca 5000 min -1

11 Ergebnisse für P450 BM-3 : Geringe Aktivität für (+)-Valencene verglichen mit dem natürlichen Substrat Geringe Regioselektivität: Wahrscheinlich verschiedene Orientationen des Substrats möglich Hohe Substratumsetzung Keine Inhibition durch Nootkatone

12 Zusammenfassung: P450 cam oxidiert Valencene mit hoher Regioselektivität aber geringer Aktivität: Wahrscheinlich nur eine Orientierung des Substrats möglich P450cam produzierte bis zu 47% Nootkatone P450 BM-3 zeigt höhere Aktivität als P450 cam P450 BM-3 zeigt geringe Regioselektivität, dadurch große Produktvielfalt Keine Inhibition durch Nootkatone bei beiden Enzymen Beide Enzyme benötigen weitere Optimierung

13 Fragen?


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