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QuantiFERON®-Gold In Tube T-SPOT.TB Test KlinFor Workshop B16 Die neuen Tuberkulose Tests Detlev Schultze Dr. med. Dipl Biol. Leitender Arzt Institut für.

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1 QuantiFERON®-Gold In Tube T-SPOT.TB Test KlinFor Workshop B16 Die neuen Tuberkulose Tests Detlev Schultze Dr. med. Dipl Biol. Leitender Arzt Institut für Klinische Mikrobiologie und Immunologie, St. Gallen

2 Lungen-Tuberkulose versus latente Infektion, CDC 2005 Latente Infektion TST oder y-Interferon positiv Röntgen Lunge negativ Keine Symptome einer Tuberkulose Proben ohne Erregernachweis Lungentuberkulose TST oder y-Interferon positiv Röntgen Lunge positiv Husten +/- Blut im Sputum +/- B-Symptomatik Positiv Mikroskopie +/- PCR +/- Kultur aus respiratorischen Proben

3 Diagnostik der Lungen Tuberkulose Identifizierung mit PCR und Gensonden Reistenztestung - Ethambutaol - Pyrazinamid - Isoniazid - Rifampicin Adaptiert nach Handbuch Tuberkulose, Lungenliga CH 2007

4 Diagnostik der latenten Tuberkulose Tuberculosis- Skin-Test (TST ) Interferon- Gamma Release Assay (IGRA) QuantiFERON-Gold In Tube [Cellestis] T-SPOT.TB [Oxford Immunotec])

5 Vergleich IGRA - TST Interferon-Gamma Release Assay (IGRA) In vitro Spezifische Antigene Keine Boosterung 1 Patienten Visite + Laborkosten Minimale Test-Variabilität Resultate in 2 Tagen Tuberculosis-Skin-Test (TST ) In vivo Weniger spezifische Antigene Boosterung 2 Patienten Visiten höhere Test-Variabilität Resultate in Tagen

6 ESAT 6 und CFP10 im Interferon-Gamma Release Assay (IGRA) Mycobacterium-Genom: Region of Difference 1 (RD1) codiert für ESX-1 Sekretionssystem zur Ausschleusung von Early Secretory Antigenic Target (ESAT-6) und Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10) aus Mycobacterium-Zelle vorhanden in Mycobacterium tuberculosis Fähigkeit zur lokalen Ausbreitung und Lyse von Pneumocyten Deletion aus Mycobacterium bovis Virulenz Minderung fehlt in attenuiertem M.bovis –Stamm = Bacille Calmette-Guérin Rekonstitution in transgenem BCG Stamm Virulenz Erhöhung Komplex mit CFP-10 und ESAT-6 EMBO Journal 2005 / Champion et al 2007 / Wards et al 2000 / Onyebujoh 2004

7 ESAT 6 und CFP 10 in Mycobacteriaceae Environmental strains Antigene ESAT-6CFP-10 M abcessus-- M avium-- M branderi-- M celatum-- M chelonae-- M fortuitum-- M gordonii-- M intracellulare-- M kansasii++ M malmoense-- M marinum++ M oenavense-- M scrofulaceum-- M smegmatis-- M szulgai++ M terrae-- M vaccae-- M xenopi-- Tuberculosis complex Antigene ESAT- 6 CFP-10 M tuberculosis++ M africanum++ M bovis++ BCG substrain gothenburg-- moreau-- tice-- tokyo-- danish-- glaxo-- montreal-- pasteur--

8 T-SPOT.TB – Blutaufbereitung in Vacutainer CPT Röhrli Röhrli zentrifugieren Röhrli zentrifugieren Lymphocyten Bande aufnehmen Lymphocyten Bande aufnehmen Lymphozyten zählen und waschen Lymphozyten zählen und waschen Lymphozyten in 96-Platte Lymphozyten in 96-Platte TB Antigene zugeben TB Antigene zugeben Übernacht Inkubation Übernacht Inkubation Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot) Technologie

9 T-SPOT.TB – Spot Bildung Platte waschen Platte waschen Detektionsreagenz zugeben Detektionsreagenz zugeben 60 min inkubieren 60 min inkubieren Platte waschen Platte waschen Farbreagenz (Substrat) zugeben Farbreagenz (Substrat) zugeben Spots innerhalb 7 min Spots innerhalb 7 min Platte waschen und trocknen Platte waschen und trocknen negativ positiv

10 T-SPOT.TB – Spot Zählung Mit blossem Auge und Vergrösserungsglas Mit blossem Auge und Vergrösserungsglas Alternativ mit automatisiertem ELISPOT imager Alternativ mit automatisiertem ELISPOT imager Above: Automated T-SPOT plate reader

11 Null TBMitogen Interferon-y Spiegel vor TB-Stimulation ? T-Zellen durch ESAT-6, CFP-10, TB7.7 stimulierbar ? T-Zellen durch Phythämagglutinin stimulierbar? QuantiFERON®-Gold In Tube

12 3x1ml Blut Inkubation 37ºC Stunden Zentrifugation 5-15 min -Interferon stabil im Kühlschrank (+4°C) 8 Wochen 1 Blut Entnahme und Vorbereitung für Test NULL TBMitogen Option 1: Versand Blutröhrchen innerhalb 16 Stunden an Labor, vor Inkubation. Option 2: Versand Blutröhrchen innerhalb 3 Tagen an Labor, nach Inkubation Option 3: Sammlung der Proben nach Zentrifugation, ans labor zur -Interferon Messung QuantiFERON®-Gold In Tube

13 Ergebnis- berechnung [IE/ml] Stop Lösung und Extinktions- Messung Waschen und Substrat Zugabe Inkubation 120 min Raum- Temperatur Plasma und Konjugat 2 γ-Interferon ELISA Positive Ergebnisse Wiederholung im Doppel Befund reproduziert Durchführung 1-2 x pro Woche QuantiFERON®-Gold In Tube

14 3 Befundung QuantiFERON®-Gold In Tube

15 QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test

16

17 QuantiFERON®-Gold In Tube – Blutentnahme bis Plasmagewinnung BlutentnahmeMassnahme bei Abweichung Röhrchen-Füllung mit Blut bis Markierung = 1 ml, Test validiert für ml Neues Röhrchen füllen TransportBeachten Lagerungsposition irrelevantvor 37°C Inkubation erneutes 5 sec- Mischen 37°C Inkubation ?- nein - ja - ja + Zentrifugation 16 Stunden °C 72 Stunden °C 8 Wochen4°C Inkubation bei 37°CMassnahme bei Abweichung Röhrchenposition aufrecht – Kappe nach obenErneute Blutentnahme PlasmagewinnungMassnahme bei Abweichung -Zentrifugation (5-15 minutes 1500–2200 g) -Sedimenation im Röhrchen abwarten und Plasma vorsichtig ohne Zellen abhebern Gel hat Blutkuchen nicht vom Plasma getrennt erneute Zentrifugation >2200g

18 QuantiFERON®-Gold In Tube Interpretation – negative Mitogen Kontrolle Kollektiv mit unterschiedlichem Immunstatusnicht stimulierbar (%) gesunde, immunkompetente Personen0.3 Patienten mit Autoimmun-Erkrankungen (anti-TNF-a)5.6 Dialyse Patienten6.8 Präanalytik nicht beachtet mangelnde Bildung IFN-y durch … heftiges Schütteln der Röhrchen (5 sec) bis Schaumbildung … geronnenes Blut … ungelöste Antigene Temperatur °C für Lagerung-/Transport Zeitintervall Blutentnahme bis Inkubation … Verfall der T-Zellen Inkubation Röhrchen für Stunden bei 37°C.… zu kurze Erwärmung Vorrats-Lagerung unbenutzter Röhrchen 4-27°C für 15 Monate … Verfall TB Antigene / Mitogen T-Zellen durch Mitogen (Phythämagglutinin) nicht stimulierbar IFN--y <0.5 IE/ml

19 Problem Beurteilung Leistung der IGRAs im Vergleich mit TST, ohne Gold Standard für die Latente TB Infektion ? Beurteilung Leistung der IGRAs im Vergleich mit TST, ohne Gold Standard für die Latente TB Infektion ? TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch 100% spezifisch TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch 100% spezifisch Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität und Spezifität der IGRAs und des TST unmöglich Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität und Spezifität der IGRAs und des TST unmöglichHypothese Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis von IGRAs Analytische Leistungsfähigkeit von IGRAs

20 Sensitivität in Probanden ohne TB, nach Ausmass Exposition TST = QFN Gold in tube = T-SPOT.TB TST = QFN Gold in tube = T-SPOT.TB von IGRAs Analytische Leistungsfähigkeit von IGRAs

21 Sensitivität in Probanden mit aktiver TB TST < QFN Gold in tube < T-SPOT.TB TST < QFN Gold in tube < T-SPOT.TB von IGRAs Analytische Leistungsfähigkeit von IGRAs

22 Spezifität bei sehr geringem Risiko einer TB Infektion TST < QFN Gold in tube = T-SPOT.TB TST < QFN Gold in tube = T-SPOT.TB von IGRAs Analytische Leistungsfähigkeit von IGRAs

23 Prädiktiver Wert Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit IGRA Ergebnissen unbekannt langfristige Kohortenstudien notwendig Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit IGRA Ergebnissen unbekannt langfristige Kohortenstudien notwendig von IGRAs Analytische Leistungsfähigkeit von IGRAs


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