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1 Lehrerfortbildung Juli 2011 Schülerversuch Geninduktion am Beispiel des lac-Operons von E.coli Prof. Dr. Andreas Beyer cand. stud. Yvonne Floer cand.

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1 1 Lehrerfortbildung Juli 2011 Schülerversuch Geninduktion am Beispiel des lac-Operons von E.coli Prof. Dr. Andreas Beyer cand. stud. Yvonne Floer cand. stud. Karina van den Broek Ein Schul-tauglicher Versuch zur Untersuchung genetischer Regulation bei Bakterien: – Induktion und Repression –

2 2 RNA -Pol Das lac-Operon lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs trans -Ac lac- Permease ßGal Lactose Gal Glc + lacZ,Y,A-mRNA

3 Lactose- Permease RNA -Pol lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs trans -Ac ßGal Lactose Gal Glc + lacZ,Y,A- mRNA Lactose Zellmembran Lactose Cytoplasma E.coli - Chromosom Transkription Translation Medium

4 4 RNA -Pol RNA -Pol Das lac-Operon: Der Repressor lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs lacI TermPromotor trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA LacR lacI-mRNA

5 LacR RNA -Pol RNA -Pol lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs lacI TermPromotor trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA LacR lacI-mRNA LacR E.coli – Chromosom Transkription Translation

6 6 RNA -Pol RNA -Pol Das lac-Operon: Der Repressor lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs lacI TermPromotor trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA LacR lacI-mRNA Lactose

7 RNA -Pol RNA -Pol lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs lacI TermPromotor trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA LacR lacI-mRNA E.coli – Chromosom Transkription Translation LactoseLactose X Trans lation

8 8 RNA -Pol RNA -Pol RNA -Pol Das lac-Operon: Glc-Repression lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs cAMP-RP TermPromotor trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA CRP-mRNA LacR Lactose CRP cAMP

9 RNA -Pol RNA -Pol RNA -Pol lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs cAMP-RP TermPromotor trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA CRP-mRNA LacR Lactose CRP cAMP CRP cAMP Translation + X Trans lation Anm: cAMP-Rezeptor-Protein (CRP) = catabolite gene activator protein (CAP)

10 10 Regulation des lac-Operons negatives Regulations-Element im Promotor: lacR bindet an Operator blockiert Transkription in Abwesenheit vom Laktose Induktor Laktose bindet an lacR LacR kann nicht mehr binden, Transkription ist entblockt positives Regulations Element im Promotor: aAMP-CRP komplex bindet an CRP-Bindestelle Transcriptionslevel wird erheblich gesteigert (Mechanismus der Katabolit-Repression)

11 11 Regulation des lac-Operons lac-Operon lacZlacAlacY TermOperatorPromotorCAPbs LacR Lactose X X CRP cAMP ++ Transkription des lac-Operons

12 12 Das Versuchsprinzip lacZ ß-Gaslactosidase als Reporter: Quantifizierung des Aktivitätsstatus des lac-Operons über Aktivitätsmessung der ß-Gal. via Chromogen: proportionale Umsetzung von oNPG durch das Enzym Quelle: chemgapedia

13 13 Zeit t in Minuten Extinktion Vorversuch: Wachstumskinetik

14 14 Vorversuch: Wachstumskinetik Glycerin verworfen

15 15 Setup des Versuchs E.coli H3000: intaktes lac-Operon Sicherheitsstamm (keine S-Stufe!) frische Übernacht-Kultur Standard-Medium LB 1:5 Verdünnung mit div. C-Quellen (Kinetik über 1h): -nur LB -Glucose -Laktose -Glucose + Laktose Zentrifugation, Zellaufschluss Zugabe von oNPG definierte Zeit Stopp optische Auswertung (semiquantitativ) Analyse: Korrelation mit den C-Quellen

16 16 Setup des Versuchs 1:5 Verdünnung bei t=0 E.coli H3000: frische Übernacht-Kultur (Standard-Medium LB) nur LB …+Glc …+Lact …+Glc +Lakt Probennahme alle 20min Zellaufschluss (Lysozym) Farb- test

17 17 Ergebnis

18 18 semiquantitative Auswertung (Semi-)Quantifizierung mit Photoshop


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