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1 maximal methodisch www.charite.de/maximalmethodisch.

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Präsentation zum Thema: "1 maximal methodisch www.charite.de/maximalmethodisch."—  Präsentation transkript:

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2 1 maximal methodisch

3 2 Durchflusszytometrie (2): DNA-Gehalt- und Zellzyklusmessungen Stephan Lobitz Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK) +

4 3 Wofür braucht man das ? Bestimmung des Chromosomensatzes einer (Misch-) Population (Euploidie, Aneuploide, Polyploidie) Veränderungen im Zellzyklus, z.B. - Tumorzellen mit erhöhter Proliferationsrate - DNA-Reparaturerkrankungen, z.B. Fanconi- Anämie mit typischem G2-Arrest

5 4 Zellzyklus

6 5 DNA-F ä rbung: Grundprinzip Der fluoreszierende Farbstoff Propidiumiodid interkaliert in DNA In einem gewissen Bereich geschieht das stöchiometrisch => Je mehr DNA, desto mehr Fluoreszenz

7 6 (Ein) Protokoll Man nehme: 70 % Methanol (EISKALT!!!) RNAse-Stockl ö sung (1 mg/ml) Propidiumjodid-Stockl ö sung (1 mg/ml) PBS mit 2 % FKS 1 diploider Standard als Kontrolle

8 7 (Ein) Protokoll Zellen pelletieren Unter starkem Vortexen mit eiskaltem Methanol überschichten und 1 Stunde fixieren Zweimal mit PBS/FKS waschen, zählen und 1 Mill. Zellen in ein FACS-Röhrchen geben Erneut pelletieren

9 8 (Ein) Protokoll Pellet in 425 µ l PBS resuspendieren 50 µ l RNAse (1 mg/ml) zugeben 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubieren 25 µ l Propidiumiodid (1 mg/ml) zugeben Messen

10 9 (Ein) Protokoll Beim Messen beachten: events registrieren Flow-Rate auf low stellen Max. 300 Zellen/Sekunde messen Beachten, dass DDM-Parameter aktiviert sind (dazu sp ä ter mehr...)

11 10 Wie war das nochmal mit dem FACSen?

12 Laser Partikel werden mit einem Laser beschossen Was steck ich vorne rein? Was kommt hinten raus? Partikeleigenschaften Detektor

13 Das gängigste Durchflusszytometer ist der FACSCalibur von BD

14 Der Calibur hat zwei Laser FL1 Roter Dioden-Laser ~635 nm SSC FL3 FL4. Blauer Argon-Laser 488 nm FL2 Flow Cell FSC

15 Der Calibur misst: FL1 Roter Dioden-Laser ~635 nm SSC FL3 FL4. Blauer Argon-Laser 488 nm FL2 Flow Cell FSC Partikelgröße (FSC) Interne Partikel- komplexität (SSC) FL-1 FL-2 FL-4 FL-3

16 15 Laser Laser Laser Zeit Spannung Zeit Spannung Zeit Spannung Umwandlung des Lichtsignals in einen Spannungspuls am Detektor

17 16 Ein Spannungspuls kann nach 3 Kriterien ausgewertet werden Zeit (µs) Volt Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Pulsweite (W) = Dauer 400

18 17 Warum ist das SOOO wichtig ????

19 18 Weil die Software routinemäßig nur die Pulshöhe aufzeichnet Zeit (µs) Volt Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Pulsweite (W) 400

20 19 Laser Laser Laser Zeit Spannung Zeit Spannung Zeit Spannung Über Pulsweite und Fläche kann man aber Einzelzellen von Aggregaten unterscheiden... Laser Laser Laser Zeit Spannung Zeit Spannung Zeit Spannung

21 20... denn Einzelzellen und Dubletten unterscheiden sich in Pulsweite und -fläche Pulsweite (W) Zeit (µs)Volt Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) 0 - aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe

22 21 Die Einzelzellbetrachtung ist bei Zellzyklusmessungen extrem relevant!!! Faktor 2 Faktor vs.

23 22 Anders gesagt: 2 x G1 macht 1 x G2

24 23 Zurück zum Problem: Die CellQuest-Software zeichnet routinemäßig nur die Höhe eines Pulses auf Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter DDM = doublet discrimination

25 24 Es werden alle drei Parameter (Höhe, Weite, Fläche) aufgezeichnet - nicht nur die Höhe !!! (Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)

26 25 Zeit Spannung G2: 1. Signal deutlich höher viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen etwas längere Dauer Zeit Spannung G1: 1. Signal deutlich niedriger viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen etwas kürzere Dauer Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal + größere Fläche Jetzt wirds richtig tricky! Gut AUFPASSEN!!!!! Die THEORIE:

27 26 Zeit Spannung G2: 1. Signal deutlich höher viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen etwas längere Dauer Zeit Spannung G1: 1. Signal deutlich niedriger viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen etwas kürzere Dauer Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal Einzellzellen FL-3-Weite FL-3-Fläche Weiter gut AUFPASSEN!!!!!

28 27 Der Beweis, dass man die richtigen Zellen ausgewählt hat... FL3-Fläche FL3-Höhe Linearer Zusammenhang zwischen Fläche und Höhe

29 28 Einzelzell- diskriminierung Der erwähnte lineare Zusammenhang G1/G0 G2/M Dazwischen: S-Phase CV als Gütekriterium Als besonderes Bonbon: Anfärbung der Mitose durch spezif. Anti-Histon-H3-Antikörper

30 29 Auswertung der Daten I Innerhalb von CellQuest Vorteil: einfach und billig Nachteil: S-Phase wird falsch niedrig bestimmt (vgl. Dean PN, J Cell Biol Feb;60(2):523-7)

31 30 Auswertung der Daten II: Spezial-Software, z.B. ModFit Wieder die Einzelzell- diskriminierung G0/G1 G2/M S

32 31 Ein Beispiel f ü r Aneuploidie

33 32 Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen Verwendung anderer Farbstoffe z.B. 7-AAD statt PI (teurer und aufwändiger, aber schmaleres Emissionsspektrum), daher günstiger bei Benutzung weiterer Antikörper Darstellung der S-Phase durch BrdU- Pulsbehandlung

34 33

35 34 Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen Anfärbung einer bestimmten Zellzyklusphase durch einen Antikörper (z.B. Mitose durch anti-Histon-H3) Trennung von Tumor- und Normal- population durch tumorspezif. Antikörper (z.B. Zytokeratinantikörper beim Colon-Ca)

36 35 Weitere Infos und Software-download www. charite.de/maximalmethodisch

37 36

38 37 Nächstes Thema: Stephanie Krämer, Tierärztin (Nephrologisches Forschungslabor) Einführung in das tierexperimentelle Arbeiten und gesetzliche Grundlagen Bitte haltet euch über die homepage auf dem Laufenden:


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