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Immunologische Nachweismethoden Block Molekularbiologische Arbeitstechniken 29.10.2004 Sandra Niemeier.

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Präsentation zum Thema: "Immunologische Nachweismethoden Block Molekularbiologische Arbeitstechniken 29.10.2004 Sandra Niemeier."—  Präsentation transkript:

1 Immunologische Nachweismethoden Block Molekularbiologische Arbeitstechniken Sandra Niemeier

2 Gliederung Antigene Antikörper Antigen-Antikörper-Reaktion Was passiert nach dem Protein-Blotting? Nachweisreaktion durch Antikörper Visualisierung Maus-Antikörper

3 Einleitung Begriff der Antigene und Antikörper aus Immunologie Antikörper in Organismen von Vertebraten unterscheiden zwischen Eigen und Fremd; spezifische Abwehr von Pathogenen (Mikroorganismen, Viren) Wandelbares + adaptives Immunsystem Hohes spezifisches Bindungsvermögen als Nachweismethode für versch. Substanzen in Bioanalytik einsetzbar

4 Antigene Immunologie: Begriff definiert durch passenden Antikörper; lösen Immunantwort aus Proteine, Polysaccharide, selten Glycolipide, synthetisch hergestellte Makromoleküle Teilbereiche auf Ag-Oberfläche reagieren mit Ak (Epitope, 5-8 Aminosäuren )

5 Antigene Voraussetzungen für Immunogenität: Chemische Differenz des Ag zum immunisierten Individuum (evolutionäre Distanz) Größe mind. bis 5-10 kDa (kleinere Peptide müssen gekoppelt werden) Zugänglichkeit der Epitope für Ak (durch Denaturierung teilw. zu verbessern) Potenz der Epitope bedingt durch Seitenketten der AS: polare + große Seitenketten sehr bestimmend

6 Antikörper Glycoproteine, sog. Immunglobuline Produziert von B-Lymphocyten ( => Knochenmark) Antikörperklassen Ig A, D, G, E, M IgG = 75% der Ak im Organismus meist gebrauchter Ak für Nachweisreaktionen leicht zu gewinnen aus Serum nach Immunisieren von Tieren gut löslich, bei 4ºC lange lagerbar kann mit anderen Substanzen kovalent gekoppelt werden Größe: 150 kDa

7 Antikörper 4 UE: 2 ident. leichte Ketten L 2 ident. schwere Ketten H Y-förmiges Molekül durch Disulfidbindung und nicht kovalente WW Leichte Kette Schwere Kette Antigen-Bindungsstelle besteht aus variabler Region der H- und L-Kette

8 Antikörper - Handhabung Problem: 1) Verlust der Antikörperaktivität Schädigung durch bakterielles Wachstum oder Aggregieren der Moleküle Lagerung bei 4ºC + Natriumazid Hinzufügen von 1% BSA 2) Austrocknung durch Einfrieren Ak am stabilsten in Form von Antiserum Einfrieren kein Problem Austrocknen bei Einfrieren kleiner Mengen Röhrchen fest verschließen, Raum über Probe mögl. klein halten, T-Schwankungen vermeiden

9 Antigen-Antikörper-Reaktion Bindung durch van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe + ionische WW, Wasserstoffbrückenbindungen Dissoziationskonstante – M (vergleichbar/größer als Enzym + Substrat) Antikörper meist divalent -> Bindung von 2 Antigenen

10 Nachweisreaktion Wenn zu untersuchendes Protein auf Membran geblottet ist… 1)Absättigen des Protein-Blots (Blocking): Um überschüssige Proteinbindestellen auf Membran zu sättigen Verhindert unspez. Bindungen der Nachweisreagenzien schwach gebundene Proteine können abgelöst werden Trocknen der Membran vor Auftragen d. Blocking-Reagenz Welche Lösungen? Nicht-ionische Detergenzien (Tween 20), nicht relevante Proteine (BSA), Proteinmischungen, Milchpulver, Kombis daraus ! Kreuzreaktionen mit Ak ausschließen

11 Nachweisreaktion 2) Bindung des Erst-Antikörpers Ak bindet an Protein auf Membran (nicht sichtbar) Inkubation 1-6 h bei RT oder üN bei 4ºC Gründliches Entfernen der Lösung (TBS) 3) Bindung des Zweit-Antikörpers an Erst-Antikörper Erforderlich zur Visualisierung Aus anderer Spezies als Erst-Antikörper Zweit-Antikörper an Enzyme, Radionuclide, Fluoreszenzfarbstoffe gebunden

12 Nachweisreaktion Weitere Brückenmoleküle anlagern um noch größere Verstärkung zu erzielen (Dritt- oder Viert-Antikörper) Verstärkung des Signals, da mehrere Zweit- Antikörper an Erst-Antikörper binden können Beispiel: Biotin-Avidin-Signalverstärkersystem Avidin bindet mit sehr hoher Affinität an Biotin am Zweit-Ak Avidin ist tetravalent, bindet 3 Enzymmoleküle Vervielfachung des Signals

13 Visualisierung 4) Geblottetes Protein mit gebundenen Antikörpern sichtbar machen A)Zweit-Antikörper trägt Radionuclid-/Fluorophormarkierung Direkte Visualisierung Radioaktiver Abfall Hoher apparativer Aufwand Radionuclide gut zur Quantifizierung geeignet (Visualisierung mit Röntgenfilm + Messung am Szintillationszähler)

14 Visualisierung B) Enzym-Markierung Indirekte Visualisierung Welche Enzyme? Meerrettichperoxidase (günstig, wenig sensitiv) Alkalische Phosphatase (hohe Sensitivität, aber teuer) Seltener ß-Galaktosidase ODER: Lichtemittierendes Produkt (Chemilumineszenz) 1 Enzymmolekül setzt viele Substratmoleküle um => Verstärkung Zur Quantifizierung nur eingeschränkt geeignet (Farbintensität schwer unterscheidbar)

15 Visualisierung Beispiel: Meerrettichperoxidase-System Zweit-Antikörper hat Meerrettich- Peroxidase gebunden Zugabe von 3,3Diaminobenzidin Umsetzung zu braunem Farbkomplex Photographieren, einscannen, bei RT im Dunkeln für kurze Zeit lagern

16 Das wars, Danke für die Aufmerksamkeit!


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