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MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA.

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Präsentation zum Thema: "MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA."—  Präsentation transkript:

1 MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)

2 MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Display-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Experiment: Genomische DNA wird isoliert (z.B. Arabidopsis, ca. 120 Mbp) und verdaut (z.B. mit EcoR1, Erkennung von 6 Basen G/AATTC). Führt zu etwa Restriktionsfragmenten. Die sind auf keinem Gel auflösbar. Es wird nur ein Schmier beobachtet. Was tun ? ( classical quotation)

3 MARKER-Typen 1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von Unterschied 2. RFLP: restriction fragment length polymorphism 3. AFLP: amplified fragment length polymorphism 4. SSLP: simple sequence length polymorphism 5. SSR: simple sequence repeat (Mikrosatellit) 6. SNP: single nucleotide polymorphism 7. CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences 8. RAPD: random amplified polymorphic DNA

4 2. RFLP

5 Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen Gelanalyse Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahl der Restriktionsfragmente aber nicht gesehen werden. Zusätzliche Restriktionsschnittstelle

6 Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus 2. RFLP

7 Mit dem RFLP-Marker können wir den Genotyp bestimmen 2. RFLP

8 3. AFLP

9 3. AFLP SPEZIFISCHE PCR Über- Anteil Genom Pflanze hang ampl bp 1 1/4 2 Bakterien 2 1/16 8 Bakterien 3 1/64 32 Hefe 4 1/ Arabidopsis 5 1/ Reis 6 1/ Zuckerrübe 7 1/ Gerste 8 1/ Weizen

10 3. AFLP VORTEIL Robustes, reproduzierbares Verfahren, das wegen der hohen Zahl amplifizierter Fragmente meist mehrere polymorphe Banden in einem Experiment liefert. Kann an einen weiten Bereich von Genomgrößen angepasst werden. NACHTEIL 1. DNA-AFLP: Banden (Merkmale) sind kaum Genen zuzuordnen 2. cDNA-AFLP: komplexe und teure Prozedur

11 4. SSLP simple sequence length polymorphism - PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik) - Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern überdeckt und mittels PCR amplifiziert - Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und verglichen.

12 4. SSLP Insertion Autoradiogramm Primer I Primer II (Analog Deletion)

13 5. SSR simple sequence length polymorphism Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Di- und Trinukeotidsequenzen (TG) 10 (TG) 12 ENTSTEHUNG Stottern der Polymerase bei der Replikation VORTEIL Schnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h. auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie

14 6. SNP single nucleotide polymorphism Unterschied in einem einzigen Basenpaar A C VORTEIL SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller Basenpaare)

15 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit

16 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit

17 7. CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences ACAC neue Schnittstelle primer Genom 1 Genom 2 1. PCR-Amplifizierung 2. Restriktionsverdau 3. Gelelektrophorese Genom 2Genom 1 Gelektrophorese

18 8. RAPD random amplified polymorphic DNA Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente Genom Individuum 1 Genom Individuum 2 Gelanalyse

19 Einsatz von molekularen Markern zur Lokalisierung von Mutationen und TILLING Auf jeden Fall aber Diagnostik

20 Einsatz von molekularen Markern zur Lokalisierung von Mutationen und TILLING Auf jeden Fall aber Diagnostik 1. Anwendung molekularer Marker 2. Diagnostik und Pflanzenschutz

21 Einsatz von molekularen Markern zur Lokalisierung von Mutationen und TILLING Auf jeden Fall aber Diagnostik 1. Anwendung molekularer Marker 2. Diagnostik und Pflanzenschutz - Viroide - Viren - Bakterien - Pilze

22 1. Viroide Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese nativ denat. Largely internally base-paired viroid RNA

23 2. Viren Trübungsmessung, automatisierbar Polyklonale Antikörper

24 3. Bakterien Bindung der Bakterien mittels Antikörper an Magnetpartikel.

25 3. Bakterien Entfernung der Targets mit einem Magneten. Kultivierung der isolierten Bakterien. Klassischer Nachweis.

26 3. Bakterien

27 4. Pilze RAPD


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