Humorale Immunität III. B-Zellreifung und Antikörper-Repertoire

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1 Humorale Immunität III. B-Zellreifung und Antikörper-Repertoire
Immunologie für Studierende der Biologie & Molekularmedizin Konzepte der Immunologie Erlangen  WS 2007/2008 Humorale Immunität III. B-Zellreifung und Antikörper-Repertoire Hans-Martin Jäck Division of Molecular Immunology Department of Internal Medicine III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum University of Erlangen-Nürnberg Zunächst möchte ich mich ganh herzlich bei den Organisatoren Prof. Thoni aus Würzburg und Prof. Schett aus Erlangen für Einladung und die Firma Roche für die hervorragende Organsiation dieser wunderbaren Veranstaltung bedanken. Ich werde Ihnen heute einen Überblick über die B-Lymphozyten und ihre Bedeutung für einerseits die humorale Immunität und anderseits für die Pathogenese von Autoimmunerkrankungen geben. Dabei werde ich folgende Themengebiete mit Ihnen diskutieren Universitätsklinikum Erlangen

2 Periphäres lymphatisches Organ
B-ZELLREIFUNG & AK-REPERTOIRE Knochenmark Prä-BZR IgM Stammzelle Pro-B-Zelle Prä-B-Zelle Unreife B-Zelle Gedächtnis- B-Zelle IgG IgM IgD +Ag +TH Plasma- zelle Naive, reife B-Zelle IgM, IgA, IgG, IgE Periphäres lymphatisches Organ

3 B-Zellreifung - Übersicht
Knochenmark z.B. Milz Plasma- zelle Ag Stamm- zelle Pro-B- Zelle Frühe Prä-B Späte Prä-B Unreife B-Zelle Reife B-Zelle Gedächtnis- B-Zelle VH →D→JH VL → JL Mature B lymphocytes develop in the bone marrow of humans and mice from hematopoetic prescursors via distinct DEVELOPMENTAL stages. The molecular hallmark of B cell maturation is the generation of the primary antibody repertoire by the stepwise assembly of exons encoding the variable or antigen binding site of an antibody from Ig segments via DNA recombination first at the H chain locus on early progenitor or pro-B cells and then a the late precursor (pre)-B stage at the IgL chain locus. Late pro-B cells with a productive IgH gene assembly an immature B cell receptor, also known as the pre-B cell receptor, undergo a limited proliferative phase of 4-6 cell divisions and differentiate into small quiescent pre-B cells. In contrast, pro-B cells with two non-productive IgH genes or, as we showed several years ago, IgH chains ubale to pair mit IgL chains are deleted. The clonally expanded functional pre-B cells mature after a successful completion of an IgL- rearrangement into immature surface IgM-positive B cells. The primary repertoire is estabislhed during the maturation of B lymphcytes from hematopoetic precursors in the bine wmarrow of humans and adult mice SLC is an invaraíant IgL chain expressed in the earliest B cell progentors even before the onset of IgH rearrangement begins at the IgH locus. Once a late- pro-B cell shas asemlebd a functional VH exon and synthesizes a functional uHC, the SLC will form togtehr with this uHC a immature B cell receptor complex, the so- Called pre-BCR. Cells which express the pre-BCR nit differentiate but also receive signals to accelarte their cell cycle, which results in the clonal epxansion of pre-B cells. In contrast, late pro-B cells without or as we showed for the frist time with dysfunctional uHC The are deleted. Therefore, the pre-BCR is part of an early checkpoint at which B cell precurorsor are screened for the presence of a functional uHC, that means one, that will assemble with IgL into a classical B cell receptor complex. A functional H chain assembles with a SLC and signaltransducing molecules into a pre-BCR which serves as a passport for late pro-B cells to differentiate and to clonallly expand. The altter is of partucluar interest since it greatly increases the repertoire since each clonally expanded pre-B cell can rearrange a different L chain Primäres B-Zell- Repertoire ~ Antikörper Vettermann et al. Sem. Immunol, 2006

4 IgH-Lokus in Stammzelle
VDJ-Rekombination VH CH Nobel Price 1987 Memban-IgH CH-Exons VH-Exon IgH-Lokus in B-Zelle IgH-Lokus in Stammzelle VH D JH Eine zusammenhängende Sequenz des V-Exons (codiert für V-Region einer Ig-Kette) und smit ein funktionelles Immunglobulingen wird durch somatische VDJ-Umlagerung von DNA-Segmenten (liegen in multiplen Kopien vor) während der Reifung B-lymphoider Zellen aus Blutstammzellen gebildet (Susumo Tonegawa, 1976)

5 Antikörper-REPERTOIRE
~ 2.3 x 106 Ab Kombinatorische Diversität CH VH CL VL CH CH2 Antigenbindungsstelle = Paratop “Magic Part” (reperire, lat. wiederfinden) ~ 134 VH VH-Regionen (ca. 6760) 13 DH 4 JH 5 CH Rekombinatorische Diversität ~ 85 Vκ Vκ-Regionen (340) 4 Jκ 1 Cκ Rekombinatorische Diversität V(D)J-Rekombination generiert Antikörperdiversität

6 Genetics and biochemistry Ig recombination
RSS = recombination signal sequences VL 7 9 9 7 JL Signal Joint Ligation XRCC4 Ligase IV V J Ku70/80 Paired complex RAG1/2 Cleaved Signal complex 1. Processing DNA-PK Artemis 2. Ligation XRCC4 Ligase IV Coding Joints

7 V(D)J-Rekombination - Genetischer Mechanismus
Vκ n Jκ Cκ DNA in stem cell Rekombinations-Signal-Sequenz (Heptamer-spacer-Nonamer) Looping-out (RAG1/2) (Signal Joint) Ligation (Nonhomologous End joining=NHEJ) Deletion (RAG1/2) (Coding Joint)

8 RSS – Rekombinationssignalsequenzen
DNA in stem cell RSS Rekombinationssignalsequenzen (RSS) RSS: bzw Motife Hepatmer (7) und Nonamer (9) sowie Länge (aber nicht Sequenz) der Spacer evolutionär hochkonser- viert Nötig für V(D)J-Umlagerung Dirigieren intrachromosomale Umlagerung Umlagerung zwischen Segmenten auf demselben Chromosom 12/23-Regel: Umlagerung normalerweise immer nur zwischen Segment mit 12bp-Spacer und Segment mit 23bp- Spacer

9 12/23-Regel: VH-nach JH-Umlagerungen
D JH DH to JH DJH VH to DJH No VH to JH X 12-RSS 23-RSS No VH to JH X Nach: Bassing et al. (2002), Cell

10 Allelausschluss - Grundlage für die Monospezifiät einer B-Zelle
Igh a/a Igh b/b Allel A Allel B Igh a/b B-Zellen exponieren entweder Igh vom Allel a oder Allel b auf der Zelloberfläche Aus Janeway, Immunobiology A B AB Allelausschluß: Das Produkt nur eines Allels wird von einer Zelle synthetisiert

11 IgH-Kette oder IgH-mRNA
Allelausschluss – Fred Alts Feedback-Modell als ein möglicher Mechanismus VH CH IgH-Kette oder mRNA Negatives Feedback durch Signale der IgH-Kette oder IgH-mRNA VH-Exon CH-Exons DNA DNA DNA

12 V(D)J-Rekombination etabliert die CDR3-Region
Keimbahn- konfiguration V D J VH-Region CDR1 CDR2 CDR3 VHDJH-Exon eines umgelagerten IgH-Gens V D J VH-Region einer IgH-Kette Sequenzen, die für die 3. hypervariable Domäne (CDR3) einer L- und H-Kette codieren, werden erst durch die Umlagerung von Ig-Segmenten gebildet

13 V(D)J-Rekombination - Biochemie
Schritt 1: Erkennung und Paarung von RSS (DNA-bindende Proteine) Schritt 2: Schneiden → Doppelstrangbrüche (Endonukleasen) Schritt 3: Prozessieren der Enden (Polymerasen, Endo- und Exonukleasen) Schritt 4: Ligieren der Enden (Ligasen) Nur in Lymphozyten (RAG1/2-Proteine) Alle Zellen „Doppelstrangbruch-reparaturproteine“ (NHEJ = Non-homologues end joining)

14 RAG1/2 - Recombination-Activating Genes
Produkte der Rekombinations-aktivierenden Gene 1 & 2 (RAG = recombination activating genes 1 & 2) RAG-Gene sind nur ca. 8kb voneinander entfernt Offene Leseraster enthalten keine Introns (→prokrayontischen Ursprungs ???) Nur in B- und T-Lymphozyten Aktivitäten: Erkennung der RSS Endonukleolytischer Einzelstrangschnitt Bildung von Haarnadel-strukturen (hairpins) Offene Leseraster RAG1 RAG2

15 Schritte 1 & 2: Erkennung und Spaltung der RSS
Durch RAG1 und RAG2 Offene Leseraster ohne Introns – Prokaryonten? Endonukleolytischer Einzelstrangschnitt und Bildung von Haarnadelstrukturen (hairpins) V J Bindung von RAG1/2 8kb RAG1 RAG2 Bildung der Synapse (12/23 Regel) Gepaarter Komplex A-C G-G T-G-P-C-C OH P A-C-P-G-G T-G-P-C-C Gespaltener Signalkomplex Spaltung A-C T-G -P-G-G OH-C-C

16 Kodierende Verknüpfung
Schritt 3&4: Prozessierung der Haarnadelstruktur & Ligierung Ligierung Kodierende Verknüpfung (Coding Joint) DNA-PKcs Artemis Öffnen der Haarnadelstruktur Prozessierung der freien Enden Ku70/80 XRCC4 Ligase IV Ku70/80 XRCC4 Ligase IV Ligierung Signalverknüpfnung (Signal Joint) Gespaltener Signalkomplex Modifiziert nach Bassing et al. (2002), Cell 109:45-55

17 Verknüpfungsdiversität durch ungenaues Prozessieren
V J Artemis DNA-PKcs G-T-A-C C-A-T-G A-T-G-G T-A-C-C G-T-A-C C-A-T-G A-T-G-G T-A-C-C G-T C-A-T-G-C-A G-G T-A-T-A-C-C G-T-A-C-G-T C-C Fill-in 5‘ Exo (Artemis) + T-G-G A-C-C G-T-A-C-G- C-A-T-G-C- P G-T-A-C-G-T-N-N- C-A-T-G-C-A-N-N- G-G C-C P N + TdT Ungenaues Prozessierung der Haarnadelschleife führt zu ver-schiedenen Verknüpfungsse-quenzen und erhöht dadurch das AK-Repertoire !!!

18 IgH-Lokus in Stammzelle
Antikörper-Repertoire VH CH Nobel Price 1987 Memban-IgH CH-Exons VH-Exon IgH-Lokus in B-Zelle IgH-Lokus in Stammzelle VH D JH Eine zusammenhängende Sequenz des V-Exons (codiert für V-Region einer Ig-Kette) und smit ein funktionelles Immunglobulingen wird durch somatische VDJ-Umlagerung von DNA-Segmenten (liegen in multiplen Kopien vor) während der Reifung B-lymphoider Zellen aus Blutstammzellen gebildet (Susumo Tonegawa, 1976)

19 Rekombinatorische & kombinatorische Diversität
~ 2.3 x 106 Ab Kombinatorische Diversität CH VH CL VL CH CH2 Antigenbindungsstelle = Paratop “Magic Part” (reperire, lat. wiederfinden) ~ 134 VH VH-Regionen (ca. 6760) 13 DH 4 JH 5 CH Rekombinatorische Diversität ~ 85 Vκ Vκ-Regionen (340) 4 Jκ 1 Cκ Rekombinatorische Diversität V(D)J-Rekombination generiert Antikörperdiversität

20 Antigen-Repertoire Die Welt der Antigene
Abhängig vom Paratop erkennt eine B-Zelle jede Struktur Protein Lipide Nukleinsäuren Kohlenhydrate Moleküle oder Haptene (Halbantigene) Sogar Plastik und Metalle (z.B. Nickel) Wieviele Paratope (Antikörperspezifiäten) ?

21 206 = 6 x 107 lineare Peptid-Epitope  6 x 107 Antikörper
Größe des Antigen-Repertoires Wieviele Antikörper werden zum Schutz gegen Pathogene benötigt? 206 = 6 x 107 lineare Peptid-Epitope  6 x 107 Antikörper Anzahl der Aminosäuren Minimale Größe eines Peptidepitopes

22 Rekombinatorische & kombinatorische Diversität
~ 2.3 x 106 Ab Kombinatorische Diversität CH VH CL VL CH CH2 Antigenbindungsstelle = Paratop “Magic Part” (reperire, lat. wiederfinden) ~ 134 VH VH-Regionen (ca. 6760) 13 DH 4 JH 5 CH Rekombinatorische Diversität ~ 85 Vκ Vκ-Regionen (340) 4 Jκ 1 Cκ Rekombinatorische Diversität V(D)J-Rekombination generiert Antikörperdiversität

23 Verknüpfungsdiversität 1 (Junctional Diversity)
 durch ungenaue Rekombination von Ig-Gensegmenten Rekombinierte DNA AA am Verknüpfungs- punkt Germline-DNA V J C C C C C C T G G Pro-Trp C G T C C C C C C T G G Pro-Arg C G C C C C C C T G G Pro-Pro C G C C C C C C T G G Frame-shift C G T

24 Verknüpfungsdiversität 2 (Junctional Diversity)
 durch Insertion von Nukleotiden vor der Ligierung .... GGG AAA TTA GTC TTC CCG ACG .... V N-Sequenzen CCT ACA D J Enzym: terminale Desoxytransferase (TdT) In B- und T-lymphoiden Vorläuferzellen Maus: nur in H-Ketten Mensch: in H- und L-Ketten Kaum N-Insertionen während der Embryonalentwicklung

25 Verknüpfungsdiversität 3 (Junctional Diversity)
 D-Segmente können in allen 3 Leseraster benützt werden durch V D J .... GGG AAA CCT TTAGTCACATTCCCG ACG AAA TTT .... AGTCACATTCCC TAGTCACATTCC Nonsense Codon

26 Diversität durch Rekombination/Mutation
 Veränderung bereits etablierter V-Exons Punktmutationen (Schaf) VH-Replacement Genkonversion (Huhn und Hase) nicht-reziproke homologe Rekombination VH-Repertoire beim Kaninchen und Huhn Aus Martin & Scharf, Nature Immunol Rev. 2002 Genkonversion

27 Antikörper-Repertoire
~ 2.3 x 106 Ab Kombinatorische Diversität CH VH CL VL CH CH2 Antigenbindungsstelle = Paratop “Magic Part” (reperire, lat. wiederfinden) ~ 134 VH VH-Regionen (ca. 6760) 13 DH 4 JH 5 CH Rekombinatorische Diversität ~ 85 Vκ Vκ-Regionen (340) Ab Verknüpfungs- diversität 4 Jκ 1 Cκ Rekombinatorische Diversität

28 Aus den nächsten vier Dias kann das Passende ausgesucht werden

29 Ermöglich effiziente humorale Abwehr gegen Pathogene
Antikörper-Repertoire Ermöglich effiziente humorale Abwehr gegen Pathogene V-Repertoire (Spezifität) Millionen von Paratopen durch Bildung von V-Exons durch Umlagerungen von Gensegmenten Selektion von Vorläuferzellen mit funktioneller Ig-Ketten V-Repertoire (Affinität) Mutationen von fertigen V- Exonsequenzen Selektion von reifen B-Zellen mit affineren BZRen Antigen- erkennung AK CH VH CL VL Während der B-Zellreifung im Knochenmark bzw. der fötalen Leber Umlagerung unabhängig von Antigen In sekundären lymphatischen Organen Induziert durch fremdes Ag und TH-Zellen in reifen IgM-B-Zellen CH CH2 Aktivierung von Effektorreaktionen CH-Repertoire 5 CH-Regionen lat. reperire dt. finden

30 Primäres und sekundäres Repertoire
Adult BONE MARROW (independent of foreign Ag) mature B IgG IgM IgD PERIPHERAL LYMPHATIC ORGAN (Induced by foreign Ag and TH cells) memory B plasma cell Ag + TH IgM Stem cell pro-B pre-B immature B Affinity maturation Somatic hypermutation of V exons Selection of high-affine BCRs IgH class-switch V(D)J rearrangement (RAG) Selection of functional IgR lat. reperire dt. finden V-Repertoire (Diversity) V-Repertoire (Affinity) CH-Repertoire (Effector)

31 Humoral immunitiy against pathogens
Background – Antibody repertoire Humoral immunitiy against pathogens Antigen recognition PERIPHERY (Induced by Ag and TH cells) CH VH CL VL CH CH2 Adult BONE MARROW (independent of foreign Ag) V-Repertoire (Affinity) Somatic Hypermutationen of V exons (AID) Selection of mature B cells with high-affine BCRs V-Repertoire (Diversity) V(D)J rearrangement (RAG) Selection and duplication of precurors with functional Ig receptors Effector reactions CH-Repertoire 5 CH Regions Class-switch recombination (AID) The primary antibody repertoire which refelcts the diversity of antrigen specificties is mainly established during the development of B cells in the BM by VDJ recombination and selection of functional B cells. However, the primary antibody repertoire can be modified in the antigen- and TH-mediated phase of B cell activation. First, somatic hypermuation of V regions, which is mediated by important regulator of the huimoral immun response, AID, and the subsequenct selection of B cells leads to affinity maturation of antibodies without changing the specificity. In addition, class-swicth recombination, also mediated by the regulator AID, will establish the CH repertoire, which is crucial for effector functions of an Ab mediated by its CH region. Now our project will focus on an IgL-like chain, the so-called surrogate light, which is a regulator controling and shaping the primary Ab repertoire.

32 Antibody Repertoire Germinal Center +TH Modified secondary Primary
Plasma cell Germinal Center IgG IgA IgE Somatic Hypermutation Selection IgH class switch Memory B +TH Memory B cell Modified secondary repertoire VH repertoire Increased affinity CH repertoire effector functions Primary VH repertoire (specificity)

33 Antikörper-Repertoire - Zusammenfassung
Repertoire für Antigenerkennung Rekombinatorische Diversität Kombinatorische Diversität Verknüpfungsdiversität Unpräzises Verknüpfen von V, D und J-Segmenten Insertionen von Nukleotiden zwischen V, D und J-Segmenten Benützen verschiedener Leseraster des D-Segments Somatische Mutation von V(D)J-Exons Repertoire für Effektorfunktionen Austausch der C-Region (insgesamt 5) durch Schwerketten-Isotyp- oder -Klassenwechsel (class switch recombination = CSR)

34 Anwesenheit und Paarung
Qualitätskontrolle der B-Zellreifung Anwesenheit und Paarung von Ig-Ketten? Kontroll- punkte Auto- reaktivität? Plasma- zelle Ag Stamm- zelle Pro-B- Zelle Frühe Prä-B Späte Prä-B Unreife B-Zelle Reife B-Zelle Gedächtnis- B-Zelle Pre-BCR BCR VH →D→JH VL → JL Vettermann et al. Sem. Immunol, 2006

35 Der Prä-B-Zellrezeptor-Kontrollpunkt
Surrogate L-Kette unique tails Unreifer und reife Ig-Rezeptoren VpreB L-Kette l5 β8 VH VH Cµ1 Cµ1 Cµ2 µH-Kette Cµ2 µH-Kette Cµ3 Igα/Igβ Cµ3 Igα/Igβ Cµ4 Cµ4 Prä-B-Zell-Rezeptor B-Zell-Rezeptor

36 Funktionen des Prä-B-Zellrezeptors
SL-Kette Ankurbeln des Zellzyklus Vervielfältigung von Prä-B-Zellen mit paarungsfähigen µH-Ketten durch selektive klonale Expansion Überlebenssignale Umleitung der V(D)J-Rekombinase vom IgH- zum IgL-Lokus ??? Allelausschluss am IgH-Lokus Öffnen des IgL-Lokus µH- Kette Igαβ Prä-BZR

37 Prä-B-Zellexpansion erhöht kombinatorische Diversität
BZR VH1 VH1VL1 Prä-BZR VH1 VH1VL2 VH1 VH1VL3 VH1 VH1VL4

38 Signalinitiierung des ‚Autoreaktiven‘ Prä-BZR
Pre-B cell autonomous Stroma cell-dependent Ligand-independent Ligand-dependent BM stroma cell Aus Vettermann et al, Sem Immunol, 2006 pre-B cell pre-B cell pre-B cell pre-B cell B C D E Signals induced by receptor assembly Signals induced by receptor self-ligation Signals induced by self-ligand Signals induced by external ligand The l5 unique region distinguisges a pre-BCR from a BCR, and thus allows pre-BCR-specific signal enhancement via binding to SELF (autoreactivity)

39 „Eliminierung“ autoreaktiver B-Zellen
Zentrale Mechanismen Deletion Anergie Editieren des Rezeptors Periphäre Mechanismen Ignoranz Kompetition VL VJ JL CL Autoreaktiver Rezeptor Editieren des Rezeptors Editierter Rezeptor

40 Reife naive B-Zell-Populationen
Knochenmark z.B. Milz Plasma- zelle Ag Stamm- zelle Pro-B- Zelle Frühe Prä-B Späte Prä-B Unreife B-Zelle Reife B-Zelle Gedächtnis- B-Zelle VH →D→JH VL → JL Mature B lymphocytes develop in the bone marrow of humans and mice from hematopoetic prescursors via distinct DEVELOPMENTAL stages. The molecular hallmark of B cell maturation is the generation of the primary antibody repertoire by the stepwise assembly of exons encoding the variable or antigen binding site of an antibody from Ig segments via DNA recombination first at the H chain locus on early progenitor or pro-B cells and then a the late precursor (pre)-B stage at the IgL chain locus. Late pro-B cells with a productive IgH gene assembly an immature B cell receptor, also known as the pre-B cell receptor, undergo a limited proliferative phase of 4-6 cell divisions and differentiate into small quiescent pre-B cells. In contrast, pro-B cells with two non-productive IgH genes or, as we showed several years ago, IgH chains ubale to pair mit IgL chains are deleted. The clonally expanded functional pre-B cells mature after a successful completion of an IgL- rearrangement into immature surface IgM-positive B cells. The primary repertoire is estabislhed during the maturation of B lymphcytes from hematopoetic precursors in the bine wmarrow of humans and adult mice SLC is an invaraíant IgL chain expressed in the earliest B cell progentors even before the onset of IgH rearrangement begins at the IgH locus. Once a late- pro-B cell shas asemlebd a functional VH exon and synthesizes a functional uHC, the SLC will form togtehr with this uHC a immature B cell receptor complex, the so- Called pre-BCR. Cells which express the pre-BCR nit differentiate but also receive signals to accelarte their cell cycle, which results in the clonal epxansion of pre-B cells. In contrast, late pro-B cells without or as we showed for the frist time with dysfunctional uHC The are deleted. Therefore, the pre-BCR is part of an early checkpoint at which B cell precurorsor are screened for the presence of a functional uHC, that means one, that will assemble with IgL into a classical B cell receptor complex. A functional H chain assembles with a SLC and signaltransducing molecules into a pre-BCR which serves as a passport for late pro-B cells to differentiate and to clonallly expand. The altter is of partucluar interest since it greatly increases the repertoire since each clonally expanded pre-B cell can rearrange a different L chain Primäres B-Zell- Repertoire ~ Antikörper Vettermann et al. Sem. Immunol, 2006

41 Ko-expression von IgM und IgD
Reife B-Zelle IgM Unreife B-Zelle IgD KM Peripheres LO Aus Janeway

42 B1-Zellen B2-Zellen Reife B-Zellpopulationen Follikuläre B-Zellen
Marginal-Zonen B-Zellen

43 B1 und Follikuläre B2-Zellen
In Peritoneal- und Pleuralhöhle Entstehen schon während der Embryonalentwicklung Selbsterneuernd T-Zell-unabhängige schnelle Antikörperproduktion Dienen der Abwehr auf mukösen Oberflächen Markers: CD5+ und IgM↑ Follikuläre B2-Zellen In allen lymphatischen Organen „Normale“ rezirkulierende B-Zellen Markers: IgM↓, IgD↑, CD21/35↑, CD23↑

44 Marginalzonen(MZ)-B2-Zellen
Residente, langlebige Zellen in der Marginal-Zone der Milz Sehr gute Immunantwort gegen Polysaccharide (Kapselbakterien) Vermitteln „frühe“ Immunabwehr gegen Erregern, die aus dem Blut in die Milz gelangen Nach Kontakt mit Antigen inner- halb von 4 Stunden Differenzier- ung in Plasmazellen Markers: IgM↑, IgD↓, CR1/2↑, CD23↓, CD1d↑ (non-klassisches MHC) Milz mit Ausschnit zeigen Cyster, Nat. Immunol. 2000