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Humorale Immunität III. B-Zellreifung und Antikörper-Repertoire Hans-Martin Jäck Division of Molecular Immunology Department of Internal Medicine III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum.

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1 Humorale Immunität III. B-Zellreifung und Antikörper-Repertoire Hans-Martin Jäck Division of Molecular Immunology Department of Internal Medicine III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum University of Erlangen-Nürnberg Universitätsklinikum Erlangen Immunologie für Studierende der Biologie & Molekularmedizin Konzepte der Immunologie Erlangen WS 2007/2008

2 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 2 B-ZELLREIFUNG & AK-REPERTOIRE Plasma-zelle IgM, IgA, IgG, IgE Gedächtnis-B-Zelle Naive, reife B-Zelle +Ag +T H Knochenmark Periphäres lymphatisches Organ Stammzelle Pro-B-Zelle Prä-B-Zelle Unreife B-Zelle IgM IgD IgG IgM Prä-BZR

3 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 3 Pro-B- Zelle Späte Prä-B Unreife B-Zelle Frühe Prä-B Stamm- zelle Vettermann et al. Sem. Immunol, 2006 B-Zellreifung - Übersicht V L J L Primäres B-Zell- Repertoire ~ Antikörper Reife B-Zelle Plasma- zelle Gedächtnis- B-Zelle Ag V HDJ H Knochenmark z.B. Milz

4 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 4 IgH-Lokus in Stammzelle IgH-Lokus in B-Zelle Memban-IgH C H -Exons VHVH CHCH V H- Exon Eine zusammenhängende Sequenz des V-Exons (codiert für V-Region einer Ig-Kette) und smit ein funktionelles Immunglobulingen wird durch somatische VDJ-Umlagerung von DNA- Segmenten (liegen in multiplen Kopien vor) während der Reifung B-lymphoider Zellen aus Blutstammzellen gebildet (Susumo Tonegawa, 1976) VDJ-Rekombination Nobel Price 1987 V H D J H

5 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 5 ~ 85 V κ V κ- Regionen (340) 4 J κ 1 C κ V H - Regionen (ca. 6760) 4 J H 5 C H ~ 134 V H 13 D H Antikörper-REPERTOIRE Rekombinatorische Diversität ~ 2.3 x 10 6 Ab Kombinatorische Diversität C H 1 V H C L V L C H 3 C H 2 Antigenbindungsstelle = Paratop Magic Part (reperire, lat. wiederfinden) V(D)J-Rekombination generiert Antikörperdiversität Rekombinatorische Diversität

6 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 6 Genetics and biochemistry Ig recombination V J VLVL 7979 JLJL RSS = recombination signal sequences Coding Joints Ku70/80 Signal Joint Ligation XRCC4 Ligase IV 1. Processing DNA-PK Artemis 2. Ligation XRCC4 Ligase IV Paired complex RAG1/2 Cleaved Signal complex

7 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 7 V(D)J-Rekombination - Genetischer Mechanismus DNA in stem cell JκJκ CκCκ Vκ1Vκ1 Vκ nVκ n (Coding Joint) (Signal Joint) Rekombinations-Signal-Sequenz (Heptamer-spacer-Nonamer) Deletion (RAG1/2) Looping-out (RAG1/2) Ligation (Nonhomologous End joining=NHEJ)

8 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 8 Rekombinationssignalsequenzen (RSS) RSS: bzw Motife Hepatmer (7) und Nonamer (9) sowie Länge (aber nicht Sequenz) der Spacer evolutionär hochkonser- viert Nötig für V(D)J-Umlagerung Dirigieren intrachromosomale Umlagerung Umlagerung zwischen Segmenten auf demselben Chromosom 12/23-Regel: Umlagerung normalerweise immer nur zwischen Segment mit 12bp-Spacer und Segment mit 23bp- Spacer DNA in stem cell RSS RSS – Rekombinationssignalsequenzen

9 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 9 Nach: Bassing et al. (2002), Cell D H to J H 23-RSS JHJH DVHVH 12-RSS DJ H V H to DJ H No V H to J H X X 12/23-Regel: V H -nach J H -Umlagerungen

10 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 10 Allelausschluss - Grundlage für die Monospezifiät einer B-Zelle Allel A Allel B Allelausschluß: Das Produkt nur eines Allels wird von einer Zelle synthetisiert A B AB B-Zellen exponieren entweder Igh vom Allel a oder Allel b auf der Zelloberfläche Aus Janeway, Immunobiology Igh a/a Igh b/b Igh a/b

11 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 11 Allelausschluss – Fred Alts Feedback-Modell als ein möglicher Mechanismus C H -Exons V H- Exon VHVH CHCH IgH-Kette oder mRNA DNA Negatives Feedback durch Signale der IgH-Kette oder IgH-mRNA

12 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 12 Sequenzen, die für die 3. hypervariable Domäne (CDR3) einer L- und H-Kette codieren, werden erst durch die Umlagerung von Ig-Segmenten gebildet V H -Region einer IgH-Kette V H DJ H -Exon eines umgelagerten IgH-Gens V D J Keimbahn- konfiguration V D J V H -Region CDR1 CDR2 CDR3 V(D)J-Rekombination etabliert die CDR3-Region

13 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 13 Schritt 1: Erkennung und Paarung von RSS (DNA-bindende Proteine) Doppelstrangbrüche Schritt 2: Schneiden Doppelstrangbrüche (Endonukleasen) Schritt 3: Prozessieren der Enden (Polymerasen, Endo- und Exonukleasen) Schritt 4: Ligieren der Enden (Ligasen) Nur in Lymphozyten (RAG1/2-Proteine) Alle Zellen Doppelstrangbruch- reparaturproteine (NHEJ = Non-homologues end joining) V(D)J-Rekombination - Biochemie

14 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 14 Produkte der Rekombinations- aktivierenden Gene 1 & 2 (RAG = recombination activating genes 1 & 2) RAG-Gene sind nur ca. 8kb voneinander entfernt Offene Leseraster enthalten keine Introns (prokrayontischen Ursprungs ???) Nur in B- und T-Lymphozyten Aktivitäten: Erkennung der RSS Endonukleolytischer Einzelstrangschnitt Bildung von Haarnadel-strukturen (hairpins) Offene Leseraster RAG1 RAG2 RAG1/2 - Recombination-Activating Genes

15 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 15 Durch RAG1 und RAG2 Offene Leseraster ohne Introns – Prokaryonten? Endonukleolytischer Einzelstrangschnitt und Bildung von Haarnadelstrukturen (hairpins) Spaltung Gespaltener Signalkomplex Bildung der Synapse (12/23 Regel) Gepaarter Komplex A-C-P-G-G T-G-P-C-C A-C T-G 8kb RAG1 RAG2 A-C G-G T-G-P-C-C OH P -P-G-G OH-C-C V J Schritte 1 & 2: Erkennung und Spaltung der RSS Bindung von RAG1/2

16 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 16 Gespaltener Signalkomplex Ku70/80 XRCC4 Ligase IV Ligierung Signalverknüpfnung (Signal Joint) Ligierung Kodierende Verknüpfung (Coding Joint) DNA-PKcs Artemis Öffnen der Haarnadelstruktur Prozessierung der freien Enden Ku70/80 XRCC4 Ligase IV Modifiziert nach Bassing et al. (2002), Cell 109:45-55 Schritt 3&4: Prozessierung der Haarnadelstruktur & Ligierung

17 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 17 G-T-A-C C-A-T-G A-T-G-G T-A-C-C G-T-A-C C-A-T-G A-T-G-G T-A-C-C G-T-A-C C-A-T-G A-T-G-G T-A-C-C Artemis DNA-PKcs G-T-A-C-G-T-N-N- C-A-T-G-C-A-N-N- G-G C-C P N + TdT G-T C-A-T-G-C-A G-G T-A-T-A-C-C G-T-A-C-G-T C-A-T-G-C-A G-G C-C Fill-in 5 Exo (Artemis) + T-G-G A-C-C G-T-A-C-G- C-A-T-G-C- P Ungenaues Prozessierung der Haarnadelschleife führt zu ver- schiedenen Verknüpfungsse- quenzen und erhöht dadurch das AK-Repertoire !!! Verknüpfungsdiversität durch ungenaues Prozessieren V J

18 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 18 IgH-Lokus in Stammzelle IgH-Lokus in B-Zelle Memban-IgH C H -Exons VHVH CHCH V H- Exon Eine zusammenhängende Sequenz des V-Exons (codiert für V-Region einer Ig-Kette) und smit ein funktionelles Immunglobulingen wird durch somatische VDJ-Umlagerung von DNA-Segmenten (liegen in multiplen Kopien vor) während der Reifung B-lymphoider Zellen aus Blutstammzellen gebildet (Susumo Tonegawa, 1976) Antikörper-Repertoire Nobel Price 1987 V H D J H

19 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 19 ~ 85 V κ V κ- Regionen (340) 4 J κ 1 C κ V H - Regionen (ca. 6760) 4 J H 5 C H ~ 134 V H 13 D H Rekombinatorische & kombinatorische Diversität Rekombinatorische Diversität ~ 2.3 x 10 6 Ab Kombinatorische Diversität C H 1 V H C L V L C H 3 C H 2 Antigenbindungsstelle = Paratop Magic Part (reperire, lat. wiederfinden) V(D)J-Rekombination generiert Antikörperdiversität Rekombinatorische Diversität

20 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 20 Die Welt der Antigene Abhängig vom Paratop erkennt eine B-Zelle jede Struktur Protein Lipide Nukleinsäuren Kohlenhydrate Moleküle oder Haptene (Halbantigene) Sogar Plastik und Metalle (z.B. Nickel) Wieviele Paratope (Antikörperspezifiäten) ? Antigen-Repertoire

21 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen = 6 x 10 7 lineare Peptid - Epitope 6 x 10 7 Antikörper Anzahl der Aminosäuren Minimale Größe eines Peptidepitopes Wieviele Antikörper werden zum Schutz gegen Pathogene benötigt? Größe des Antigen-Repertoires

22 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 22 ~ 85 V κ V κ- Regionen (340) 4 J κ 1 C κ V H - Regionen (ca. 6760) 4 J H 5 C H ~ 134 V H 13 D H Rekombinatorische & kombinatorische Diversität Rekombinatorische Diversität ~ 2.3 x 10 6 Ab Kombinatorische Diversität C H 1 V H C L V L C H 3 C H 2 Antigenbindungsstelle = Paratop Magic Part (reperire, lat. wiederfinden) V(D)J-Rekombination generiert Antikörperdiversität Rekombinatorische Diversität

23 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 23 Germline-DNA Rekombinierte DNA AA am Verknüpfungs- punkt CCCCTGCCG V J CCCCTGCCG CCCCTGCCG CCCCTGCCG Frame-shift CCCGTCG Pro-Pro CCCGCC Pro-Arg CCCGGC Pro-Trp CCCGGT durch ungenaue Rekombination von Ig-Gensegmenten Verknüpfungsdiversität 1 (Junctional Diversity)

24 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 24 JD V.... GGG AAA TTA GTC TTC CCG ACG.... Enzym: terminale Desoxytransferase (TdT) In B- und T-lymphoiden Vorläuferzellen Maus: nur in H-Ketten Mensch: in H- und L-Ketten Kaum N-Insertionen während der Embryonalentwicklung N-Sequenzen CCT ACA durch Insertion von Nukleotiden vor der Ligierung Verknüpfungsdiversität 2 (Junctional Diversity)

25 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 25 J D V.... GGG AAA CCT TTAGTCACATTCCCG ACG AAA TTT.... AGTCACATTCCC TAGTCACATTCC Nonsense Codon D-Segmente können in allen 3 Leseraster benützt werden durch Verknüpfungsdiversität 3 (Junctional Diversity)

26 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 26 Punktmutationen (Schaf) V H -Replacement Genkonversion (Huhn und Hase) onicht-reziproke homologe Rekombination oV H -Repertoire beim Kaninchen und Huhn Aus Martin & Scharf, Nature Immunol Rev Genkonversion Diversität durch Rekombination/Mutation Veränderung bereits etablierter V-Exons

27 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 27 ~ 85 V κ V κ- Regionen (340) 4 J κ 1 C κ V H - Regionen (ca. 6760) 4 J H 5 C H ~ 134 V H 13 D H Antikörper-Repertoire Rekombinatorische Diversität ~ 2.3 x 10 6 Ab Kombinatorische Diversität C H 1 V H C L V L C H 3 C H 2 Antigenbindungsstelle = Paratop Magic Part (reperire, lat. wiederfinden) Rekombinatorische Diversität Ab Verknüpfungs- diversität

28 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 28 Aus den nächsten vier Dias kann das Passende ausgesucht werden

29 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 29 C H 1 V H C L V L C H 3 C H 2 AK V-Repertoire (Spezifität) Millionen von Paratopen durch Bildung von V-Exons durch Umlagerungen von Gensegmenten Selektion von Vorläuferzellen mit funktioneller Ig-Ketten Aktivierung von Effektorreaktionen C H -Repertoire 5 C H -Regionen Ermöglich effiziente humorale Abwehr gegen Pathogene V-Repertoire (Affinität) Mutationen von fertigen V- Exonsequenzen Selektion von reifen B-Zellen mit affineren BZRen In sekundären lymphatischen Organen Induziert durch fremdes Ag und T H -Zellen in reifen IgM-B-Zellen Während der B-Zellreifung im Knochenmark bzw. der fötalen Leber Umlagerung unabhängig von Antigen Antigen- erkennung lat. reperire dt. finden Antikörper-Repertoire

30 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 30 pro-BStem cellimmature B V-Repertoire (Diversity) V-Repertoire (Affinity) C H -Repertoire (Effector) V(D)J rearrangement (RAG) Selection of functional IgR IgM Adult BONE MARROW (independent of foreign Ag) Affinity maturation Somatic hypermutation of V exons Selection of high-affine BCRs IgH class-switch mature B IgG IgM IgD PERIPHERAL LYMPHATIC ORGAN (Induced by foreign Ag and T H cells ) memory B plasma cell Ag + T H pre-B lat. reperire dt. finden Primäres und sekundäres Repertoire

31 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 31 Background – Antibody repertoire C H 1 V H C L V L C H 3 C H 2 V-Repertoire (Diversity) V(D)J rearrangement (RAG) Selection and duplication of precurors with functional Ig receptors Effector reactions C H -Repertoire 5 C H Regions Class-switch recombination (AID) Humoral immunitiy against pathogens V-Repertoire (Affinity) Somatic Hypermutationen of V exons (AID) Selection of mature B cells with high-affine BCRs Antigen recognition PERIPHERY (Induced by Ag and T H cells ) Adult BONE MARROW (independent of foreign Ag)

32 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 32 Antibody Repertoire Primary V H repertoire (specificity) Memory B cell Germinal Center Somatic Hypermutation Selection IgH class switch Memory B Plasma cell +T H IgG IgA IgE Modified secondary repertoire VH repertoire Increased affinity CH repertoire effector functions

33 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 33 Antikörper-Repertoire - Zusammenfassung 1.Rekombinatorische Diversität 2.Kombinatorische Diversität 3.Verknüpfungsdiversität Unpräzises Verknüpfen von V, D und J-Segmenten Insertionen von Nukleotiden zwischen V, D und J-Segmenten Benützen verschiedener Leseraster des D-Segments 4.Somatische Mutation von V(D)J-Exons Repertoire für Antigenerkennung Repertoire für Effektorfunktionen Austausch der C-Region (insgesamt 5) durch Schwerketten-Isotyp- oder -Klassenwechsel (class switch recombination = CSR)

34 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 34 Pro-B- Zelle Späte Prä-B Unreife B-Zelle Frühe Prä-B Stamm- zelle Vettermann et al. Sem. Immunol, 2006 Qualitätskontrolle der B-Zellreifung V L J L Auto- reaktivität? Anwesenheit und Paarung von Ig-Ketten? Kontroll- punkte Reife B-Zelle Plasma- zelle Gedächtnis- B-Zelle Ag V H D J H BCR Pre-BCR

35 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 35 Ig α /Ig β Cµ1Cµ1 Cµ2Cµ2 Cµ3Cµ3 Cµ4Cµ4 VHVH L-Kette µH-Kette Cµ1Cµ1 Cµ2Cµ2 Cµ3Cµ3 Cµ4Cµ4 VHVH VpreB 5 µH-Kette β8β8 Ig α /Ig β unique tails Prä-B-Zell-Rezeptor B-Zell-Rezeptor Der Prä-B-Zellrezeptor-Kontrollpunkt Surrogate L-Kette Unreifer und reife Ig-Rezeptoren

36 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 36 Ankurbeln des Zellzyklus Vervielfältigung von Prä-B-Zellen mit paarungsfähigen µH-Ketten durch selektive klonale Expansion Überlebenssignale Umleitung der V(D)J-Rekombinase vom IgH- zum IgL-Lokus ??? Allelausschluss am IgH-Lokus Öffnen des IgL-Lokus Prä-BZR µH- Kette Ig αβ Funktionen des Prä-B-Zellrezeptors SL-Kette

37 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 37 Prä-BZR VH1VH1VH1VL1VH1VL1 BZR VH1VH1VH1VL2VH1VL2 VH1VH1VH1VL3VH1VL3 VH1VH1VH1VL4VH1VL4 Prä-B-Zellexpansion erhöht kombinatorische Diversität

38 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 38 Signals induced by receptor assembly Signals induced by receptor self-ligation Signals induced by external ligand Ligand-independentLigand-dependent pre-B cell B C Signals induced by self-ligand pre-B cell D BM stroma cell pre-B cell E Pre-B cell autonomousStroma cell-dependent Aus Vettermann et al, Sem Immunol, 2006 The 5 unique region distinguisges a pre-BCR from a BCR, and thus allows pre-BCR-specific signal enhancement via binding to SELF (autoreactivity) Signalinitiierung des Autoreaktiven Prä-BZR

39 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 39 Eliminierung autoreaktiver B-Zellen Zentrale Mechanismen Deletion Anergie Editieren des Rezeptors Periphäre Mechanismen Ignoranz Anergie Kompetition V L VJ J L C L Autoreaktiver Rezeptor Editieren des Rezeptors Editierter Rezeptor

40 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 40 Pro-B- Zelle Späte Prä-B Unreife B-Zelle Frühe Prä-B Stamm- zelle Vettermann et al. Sem. Immunol, 2006 Reife naive B-Zell-Populationen V L J L Primäres B-Zell- Repertoire ~ Antikörper Reife B-Zelle Plasma- zelle Gedächtnis- B-Zelle Ag V HDJ H Knochenmark z.B. Milz

41 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 41 Ko-expression von IgM und IgD Aus Janeway Unreife B-Zelle Reife B-Zelle KM Peripheres LO IgM IgD IgM

42 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 42 B1-Zellen B2-Zellen –Follikuläre B-Zellen –Marginal-Zonen B-Zellen Reife B-Zellpopulationen

43 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 43 B1-Zellen In Peritoneal- und Pleuralhöhle Entstehen schon während der Embryonalentwicklung Selbsterneuernd T-Zell-unabhängige schnelle Antikörperproduktion Dienen der Abwehr auf mukösen Oberflächen Markers: CD5+ und IgM Follikuläre B2-Zellen In allen lymphatischen Organen Normale rezirkulierende B-Zellen Markers: IgM, IgD, CD21/35, CD23 B1 und Follikuläre B2-Zellen

44 Division of Molecular Immunology, Universitätsklinikum Erlangen 44 Residente, langlebige Zellen in der Marginal-Zone der Milz Sehr gute Immunantwort gegen Polysaccharide (Kapselbakterien) Vermitteln frühe Immunabwehr gegen Erregern, die aus dem Blut in die Milz gelangen Nach Kontakt mit Antigen inner- halb von 4 Stunden Differenzier- ung in Plasmazellen Markers: IgM, IgD, CR1/2, CD23, CD1d (non-klassisches MHC) Cyster, Nat. Immunol Marginalzonen(MZ)-B2-Zellen Milz mit Ausschnit zeigen


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