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1 Konzepte der Immunologie für Naturwissenschaftler (MOLIM-S1) SS 2007 Humorale Immunität Humorale Immunität (Antikörper – Methoden & Anwendungen) Prof.

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1 1 Konzepte der Immunologie für Naturwissenschaftler (MOLIM-S1) SS 2007 Humorale Immunität Humorale Immunität (Antikörper – Methoden & Anwendungen) Prof. Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie an der Medizinischen Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum Tel.:

2 2 Prof. Dr. Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie an der Medizinischen Klinik III Thema 2: Antikörper - Anwendungen SS 2005 HUMORALE IMMUNITÄT Ak/Ag-Reaktionen Gewinnung spezifischer AK Anwendungen – Diagnostik & Forschung Anwendungen – Therapie

3 3 Variable Region der H- und L-Kette definiert die Spezifität Konstante Region der H-Kette bestimmt die biochemischen und biologischen Eigen- schaften (Effektorfunktion) VLVL CLCL VHVH CH1CH1 CH2CH2 CH3CH3 Antikörper sind bifunktional

4 4 Antikörper – Antigenreaktionen HV2 (CDR2) Epitop – Bindungsstelle im Ag Paratop – Bindungsstelle im AK HV3 (CDR3) HV1 (CDR1) Aus Janeway: Immunobiology Hypervariable (HV) Regionen (oder CDRs) der H- und L-Kette bilden das Paratop

5 5 Wasserstoffbindungen Brückenbildung zwischen Sauerstoff- oder Stickstoffatomen von Antigen und Antikörper (Ag-O - H - O-Ak oder Ag-N - H - N-Ak) Elektrostatische Kräfte entstehen, wenn sich positive und negative freie Ladungen auf Antigen und Antikörper gegenüber liegen Van der Waals-Kräfte resultieren aus der Interaktion zwischen Elektronenwolken (Dipole) Hydrophobe Wechselwirkungen basieren auf einer Verdrängung von Wasser- Molekülen durch apolare, hydrophobe Gruppen (aromatische Aminosäuren). Diese Bindungsart kann bis zu 50% der Bindungskräfte ausmachen. Wechselwirkungen

6 6 k D = Mol -1 Antigenbindungsstelle des Antikörpers Epitop des Antigens B Anziehungskräfte wirken nur über sehr kleine Distanzen k D = Mol -1 Antigenbindungsstelle des Antikörpers Epitop des Antigens B Nieder- und hochaffine Antikörper

7 7 Antigen (Antikörper generierend) Jede Substanz, die an einen Antigenrezeptor bindet. Antigenrezeptoren sind Immunglobuline und T-Zellrezeptoren Immunogen Substanz, die nach Injektion oder Infektion eine Antikörperantwort auslöst Gut: Proteine und Kohlenhydrate Schwach: DNA, Lipide, kurze Polypeptide Negativ: Aminosäuren, Haptene Hapten (Halbantigen) Kleines chemisch synthetisiertes Molekül, das an Rezeptor bindet, alleine aber keine Immunantwort auslöst. Immunogen nach Kopplung an Trägerprotein Epitop bzw. immunogene Determinante Der Bereich eines Immunogens, der mit dem Antikörper interagiert (bei Proteinen: 6-8 Aminosäurereste) Antigene – Definitionen und Struktur Aus: Kuby, Immunology B-Zell-Epitope Konformations- epitop Lineares Epitop Neo- Epitop

8 8 B-Zell-Antigene - Einteilung Nach Herkunft Natürlich (Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, bakt. Toxine, Zellen) Synthetisch (Haptene, Polypeptide) Nach chemischen Gesichtspunkten Proteine Kohlenhydrate Nukleinsäuren Konjugierte Proteine (Hapten-Protein) Polypeptide Lipide Nach genetischer Beziehung zwischen Spender und Empfänger Autoantigen - aus dem zu immunisierenden Individuum Isoantigen- aus einem genetisch identischen (syngenen) Spender (Inzuchtmäuse) Alloantigen - aus einem nichtverwandeten Spender derselben Spezies (Bl6, Balb/c) Xenoantigen - aus einem Spender einer anderen Spezies

9 9 Vergleich von B-Zell- und T-Zellepitopen BZR TZR Ag MHC II MHC I Antigen- prozessierung und -präsentation Aus Janeway

10 10 AFFINITÄT Maß für die Stärke der Wechselwirkung zwischen einer Ag-Bindungsstelle (Paratop) auf dem AK und einem Epitop auf dem Antigen Gute Affinität: k a = M -1 Mittlere Affinität: k a = M -1 AVIDITÄT Maß für die Stärke, mit der ein bivalenter Antikörper an ein intaktes polyvalentes Antigen (z.B. Bakterien und Viren) bindet Größer als Affinität Affinität und Avidität lec06/lec6_97.html

11 11 Natürliche Antigene, wie beispielsweise Viren oder Bakterien besitzen viele gleiche Antigen- Determinanten auf ihrer Oberfläche. Wenn ein multivalentes Antigen sich mit mehr als einer Fab-Region des Antikörpers verbindet, ist die entstehende Bindungsenergie beträchtlich grösser als die Summe der beteiligten Einzelbindungen, da sämtliche Ag-Ak Bindungen gleichzeitig aufgebrochen werden müssen, wenn Ag und Ak sich wieder trennen sollen. Falls eine Fab-Stelle loslässt, ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine andere Fab- Region des Ak gerade gebunden ist, recht gross, was die Bindungsstärke mehr als nur verdoppelt. Die Kraft, die ein solcher multivalentes Ag mit einem multivalenten Ak bindet nennt man Avidität, sie ist, wie in der Abbildung dargestellt zwischen 103 und 107 mal stärker als die entsprechende Affinität. Unter physiologischen Bedingungen spielt die Avidität eine wichtigere Rolle, im Labor findet jedoch die Affinität häufiger Verwendung. Quelle: leider verloren gegangen Avidität (eine weitere Erklärung)

12 12 Polyklonale Antiseren Heterogenes Gemisch von Antikörper, die ver- schiedene Epitope auf dem Immunogen erkennen Immunisieren von Tieren mit Antigen in komplettem Freunds Adjuvans [besteht aus Mineralöl ( Depot- wirkung) und abgetöteten Tuberkelbazil- len(unspezifische Aktivierung von DZ u. M )] Immunisierungen werden mehrmals wiederholt (Boosts) Monoklonale Antikörper homogener Antikörper, der nur ein Epitop auf dem Immunogen erkennt Immunisierung von Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen oder (Mensch) Generierung von Hybridomen Gewinnung spezifischer Antikörper Immunisierung von Labortieren mit Antigenen

13 13 Aus Kuby Hypoxanthin Hypoxanthin- Guanin- Phospho- ribosyl- transferase (HGPRT + ) Salvage Pathway Thymidin Thymidin- kinase (TK + ) De Novo Nukleotide DNA, RNA Aminopterin blockiert De Novo Purin- und Pyrimidinsynthese Myelom HGPRT + Ig + sterblich Milz-B HGPRT - Ig - unsterblich Amin- opterin PEG Hybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler Antikörper (Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984) HAT-Medium: Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin B-Zell/Myelom-Hybrid Ig + HGPRT + unsterblich

14 14 Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert. Anti-isotypische AK (gegen Epitope in C-Regionen der H- und L-Kette) Antikörper gegen Immunglobuline BALB/c Gegen verschiedene AK-Klassen (iso) C57Bl/6 Die konstante Region der H-Kette aus einer BALB/c-Maus (weiß) und einer C57Bl/6-Maus (schwarz) unterscheidet sich in einer Aminosäure verschiedene Allotypen codiert durch Varianten desselben Gens bzw. Allels) BALB/c Anti-allotypische AK (gegen ein bestimmtes Epitop In C-Region) Gegen verschiedene Formen eines bestimmten AK (allo) Anti-idiotypische AK (gegen Epitope in V-Regionen der H- und L-Kette) Gegen eine bestimmte (private= idio) Form eines AK

15 15 Isolierung von V H und V L -DNA-Fragmenten aus B-Zellen mittels PCR Klonierung der V H - und V L -Fragmente in Bakteriophagen-Vektoren Transformation in E.coli Isolierung spezifischer Antikörperphagen mittels Affinitätschromatographie oder Panning an immobilisiertem Antigen B-Zellen aus immunisiertem oder nicht-immuninisiertem Tier Phagenantikörper- Bücherei Aus Janeway: Immunobiology Antikörperphagen Klonierung in Phagenvektor Isolierung durch Panning

16 16 Natürlich vorkommender, monospezifischer IgG-Antikörper Rekombinante Manipulation Antikörper und Antikörper (Ak)-Fragmente C H 1 V H C L V L C H 3 C H 2 F(ab) 2 Pepsin- verdau Papain- verdau Fab Fd (Fragment of Domains) Diabody scFv (Single-chain Fragment of Varibale regions) Rekombinant in E.coli, Hefe und Insekten- bzw. Säugetierzellen Bispezifischer IgG-Antikörper

17 17 Muriner Ak Humanisierter, chimärer Ak Humaner Ak Chimärer Ak Sequenzen des Paratops (Hyper- varibale Region = CDR) im humanen Ak werden rekombinant durch entsprechende Sequenzen aus Maus-Ak ersetzt Murine V H -Region Humanisierte Maus-Antikörper Chimäre - feuerspeiendes Ungeheuer aus der griechischen Mythologie mit dem Kopf eines Löwen, dem Körper einer Ziege und dem Schwanz eines Drachen.

18 18 Anwendungen von Antikörper in Forschung und klinischer Diagnose oNachweis und Quantifizieren löslicher Moleküle oNachweis intrazellulärer und membrangebundener Proteine auf Einzelzellniveau oNachweis und Quantifizierung von Zellpopulationen innerhalb einer Zellsuspension oNachweis sezernierender Zellen oAnreicherung und Isolierung definierter Zellpopulationen oProteinreinigung und Untersuchung von Proteinkomplexen oNachweis von Protein-Protein-Interaktionen

19 19 Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle In Lösung: Heidelberger Titrationskurve Menge der Ak-Ag-Komplexe Antigen-Konzentration Antikörper-Konzentration Aus Janeway: Immunobiology

20 20 Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony Antigen und Antiserum werden in Ver- tiefungen in der Agarmatrix pipettiert Ag1 und Ag 3 haben keine gemeinsamen Epiotope, i.e., sie sind verschiedenen Ag1 und Ag 2 besitzen identische Epiotope Beispiel: Antikörper Antigen Agarmatrix Präzipitatslinie Anfärben Prinzip: Aus Janeway: Immunobiology

21 21 Quantitativer Nachweis von Antigenen (z.B. Serum IgG) Antikörper wird in Agar eingegossen Antigen wird in Vertiefung gegeben Diffusion des Antigens Äquivalenzpunkt => Präzipitation Durchmesser des Präzipitationsrings ~ Konzentration Mitführen eines Ag-Standard Bestimmung der Ag-Konzentration aus Eichkurve Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini) Ak Ag Ak Ag Präzipitations- ring Durch- messer

22 22 H2O2H2O2 2 H 2 O direkt capture indirekt Enzym Antigen ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Qualitativer und quantitativer Nachweis löslicher Moleküle mit spez. AK Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle

23 23 Übliche Enzyme Alkalische Phosphatase (AP) Meerrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase = HRP) N O H H H N O H H 2 O 2 2 H 2 O Konjugiertes -Elektronensystem farbig farblos O PN+N+ O O-O- N+N+ O O-O- gelb farblos OH - OH O O-O- O-O- P O O-O- O-O- + + H 2 O

24 24 Schwangerschaftsnachweis durch Agglutinationsinhibition HCG human chorionic gonadotropin Humanes Chorion-Gonadotropin Schwangerschaftshormon Wird zuerst von Blastozyste, dann von Plazenta gebildet Kann bereits 6-15 Tage nach der Befruchtung im Urin nachgewiesen werden Verantwortlich für morgentliches Erbrechen Aus Janeway nicht schwanger schwanger Kein HCG Im Urin HCG Im Urin

25 25 Blutgruppennachweis durch Hämagglutinationsreaktion Agglutination: Verklumpung korpuskulärer Bestandteile durch Anti-körper Aus Janeway

26 26 Nachweis von Antigenen in und auf Zellen Photoimmunfluoreszenz Durchflusszytometrie Analyse eines Antigens auf Einzelzellbasis

27 27 Photoimmunfluoreszenz AK Zelle Fluoro- chrom (FITC) + AK + irrelevanter AK Aus Janeway: Immunobiology

28 28 Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellen Aus Janeway, Immunobiology Zellgöße Granularität Rot Grün z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz FITC-anti-CD4 PE-anti-CD8 Zell- göße Granularität (Düse) Photozellen

29 29 FACS steht für Fluorescence activated cell sorting und beschreibt ein Verfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Der Ausdruck "FACS" ist eine geschützte Handelsmarke der Firma Becton Dickinson. Der Name ist eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung vorgenommen wird, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von Zellen Die allgemeine Bezeichnung des Verfahrens lautet Durchflusszytometrie. Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahlpassiert. Durchflusszytometrie und FACS

30 30 Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellen Aus Janeway, Immunobiology Zellgöße Granularität Rot Grün z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz Dotplots FI (FITC anti-CD8) FI (PE anti-CD4) FITC-anti-CD8 PE-anti-CD4 Zellzahl Histogramm Fluoreszenzintensität = FI () PE anti-CD4 FITC anti-CD8

31 31 Quantitativer Nachweis sezernierender Zellen Jerne-Plaque-Assay Durchflusszytometrie Elispot-Assay Bestimmung der Frequenz sezernierender Zellen

32 32 Hemolytischer (Jerne) Plaque Assay (N. Jerne, A. Nordin & C. Henry) Aus Kuby, 4th edition SRBC:sheep red blood cells PFC:plaque-forming units Plasmazelle Bestimmung der Frequenz AK-sezernierender Plasmazellen in einer Milzzellkultur

33 33 Nachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-Technik Bestimmung der Frequenz Zytokin-sezernierender Milzzellen vor und nach Stimulierung Aus Janeway 4th edition + - Animation unter:

34 34 Durchflusszytometrischer Nachweis sezernierender Zellen Beispiel:Nachweis Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (Assay nach Milteny Biotech) Zellen werden mit IFN- γ Catch-Reagent beladen Zellen werden stimuliert IFN- wird sezerniert und von IFN- -Catch abgefangen Gebundenes IFN- wird mit Fluorochrom -konjugierten (PE) anti- IFN- -Ak inkubiert Zellen können durchflusszytometrisch analysiert Alternativ können Zellen mit magne- tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN- sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden PE (PE anti-IFN γ)

35 35 Isolierung definierter Zellpopulationen Sortierung von Zellen anhand von Oberflächenproteinen Magnetische Methode (MACS) Durchflusszytometrsiche Methode (FACS) Aus Janeway: Immunobiology

36 36 Anreicherung sezernierter Zellen mittels der FACS- oder MACS-Technik Beispiel:Anreicherung Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (nach der FACS/MACS-Methode von Milteny Biotech) Zellen werden mit IFN- γ Catch-Reagent beladen Zellen werden stimuliert IFN- wird sezerniert und von IFN- -Catch abgefangen Gebundenes IFN- wird mit Fluorochrom -konjugierten (PE) anti- IFN- -Ak inkubiert Zellen können durchflusszytometrisch analysiert und gleichzeitig durchflusszytometrisch sortiert werden Alternativ können Zellen mit magne- tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN- sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden Magnetisierbare anti-PE-AK

37 37 Proteinaufreinigung und Analyse von Proteinkomplexen Aufreinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie Aus Janeway: Immunobiology

38 38 Immunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter Polypeptide Metabolische Markierung IgM-produzierende Zellen Anti- H-Ak kD St Zellkultur-Überstand 2.Zell-Lysat Autoradio- oder Fluorogramm Aus Janeway: Immunobiology

39 39 Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer kombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalyse Versuch:Untersuchung des Einflusses einer IgL-Kette auf die Interaktion einer IgH-Kette mit dem Chaperon BiP Membran IP: anti-IgH Zelllysate aus H + und H + L + Plasmalinie Elektrophorese SDS-Polyacyl- amidgel Elektro- transfer anti- IgH (1) anti- BiP (2) Enzym- konjugierte Sekundär- antikörper HL H IgH Zelllinie BiP

40 40 oImmundefizienz oEntzündung oAutoimmunität oInfektion oKrebs Anwendungen von AK in der Therapie

41 41 Tumor- oder HIV-infizierte Zelle Tumorantigen oder Virales Hüllprotein Modifizierte Antikörper als Virus- bzw- Tumortherapeutika kill Killer- T-Zelle kill Toxin/ Isotop Immunotoxin oder nativer AK Immunotoxin oder nativer AK TZR Bispezifischer Antikörper Retuximab Anti-CD20 AK (B-Lymphome) (http://www.prolife.de/ aktuelles/38.html)

42 42 Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 5. Blockieren 1. Signalisieren 2.Antikörper-abhängige zellvermittelte Zyto- toxizität (ADCC) 3.Komplement- abhängige zell-vermittelte Zytotoxizität (CDC) 4.Transport zytotoxischer Substanzen Promotionsvortrag 2007 Dr. Michael Schwemmlein FAU Lehrstuhl für Genetik

43 43 Katalytische Antikörper (Abzyme) (Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986) Conventional Antibody CatalyticAntibody Bindsantigenbut doesnotcleave Is"used" upduring reaction Bindsantigenandcleavesit Isregeneratedafterreaction

44 44 L.C.Hsieh-Wilson, P.G.Schultz, and R.C.Stevens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: (1996). Periodatoxidation von p-Nitro-Toluol-methyl-Sulfid zu Sulfoxid Instabiler Übergangszustand Hapten (Stabiles Analog zum Übergangszustand) Amino- phosphonsäure

45 45 Enzymatische Spaltung und Inaktivierung von Kokain (Landy and coworkers, New York 1993) Cocaine Cleavage Products (inactive) (active) N O O O OCH 3 H C 3 HO N O O O OCH 3 H C 3 HO N O OH O OCH 3 H C 3 HO C + Unstable Transition State N O O O OCH 3 H C 3 HO P Stable Transition State Analog


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