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Probensammlung PROBEN URINE GEWEBE (TURBT/CE) Vorbereitung für RNA-Extraktion V73 RNA-Isolation mittels Invisorb V13 cDNA-Synthese mittels Superscript.

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1 Probensammlung PROBEN URINE GEWEBE (TURBT/CE) Vorbereitung für RNA-Extraktion V73 RNA-Isolation mittels Invisorb V13 cDNA-Synthese mittels Superscript RNAse H Reverse Transcriptase (blind->anfängliche Messung am Agilent->immer nichts dringewesen, weil Konz.zu niedrig) V58 LC-PCR Referenzgen(e) cDNA 1:2 verdünnt; NWG= 20mol (unverdünnt) LC-PCR BCa-Marker V45 Agarosegelelektrophorese (Kontrolle, ob Doppelbanden) V42 In flüssigem Stickstoff aus OP holen, dann wegfrieren Kryoschnitte RNA-Isolation mittels Invisorb HE-Färbung (Begutachtung TZG durch Pathologin M.Toma) V60 V17 V59 Bestimmung RNA-Gehalt am Agilent Je nach RNA-Konz. V x = 500ng/c Agilent a) > 50ng->ml-Menge mit 500ng ausrechen und A.d. bis zu 10µl ergänzen b) < 50ng + <39µl: V x abpipettieren, Einengen in Speed Vac+in 10µl A.d.lösen 500ng c) 39µl: komplett einrotieren+in A.d.lösen 39-fache Ausgangskonz. V58 cDNA-Synthese mittels Superscript RNAse H Reverse Transcriptase V62 LC-PCR Referenzgen(e)+BCa-Marker cDNA 1:5 verdünnt; NWG= 50 mol (unverdünnt) Agarosegelelektrophorese (Kontrolle Doppelbanden) V42 V45 Urinzytologie (Begutachtung durch A.Twelker-Baldauf) V30/31 Urinsediment (Vergrößerung...) V73

2 Etablierung neuer Gene (UCA1/CK20) BLOCK-PCR Gradienten-PCR? Agarosegelelektrophorese 1 Bande an gewünschter Stelle? Großansatz Block-PCR Richtiges (sauberes) Fragment Agarosegelelektrophorese V42 Bande ausschneiden Gelelution mit Fa.Amersham V42 V43 Konzentrationsbestimmung am Photometer Evtl.am Agilent für genauere Konzentrationsbestimmung bei geringen Konz. Fragmentlänge UCA1: 95bp; CK20 490bp: 78bp V34 V32 Ligation von DNA-Fragment (Insert) in Vektor (bei Amplifikation m.Taq-Polymerase: Poly-A-Schwanz schon am Fragment vorhanden) V35 KLONIERUNG Transformation mittels Elektroporation Transformation mittels Hitzeschock V36

3 Ausstreichen auf LB-Platten Inkubation bei 37°C über Nacht (ÜN) Weiße Bakterienkolonien Blaue Bakterienkolonie Einbau des Fragments in Vektor in LAC-Z-Gen o.gar kein Plasmid enthalten keine Umwandlung X-GAL Kein Einbau des Fragments in Vektor Umwandlung X-GAL Klone picken (ca.2-4) Jeweils 1 Einzelkolonie in 2ml LB-Medium+Antibiotika (Verhinderung Wachstum anderer Kolonien) Agarplatte mit restlichen Kolonien verbleibt bis zum Ende der Klonierung (mit Plastikfolie abgedeckt) im Kühlschrank Nachpicken jederzeit möglich Plasmid-Minipräparation von allen gepickten Klonen Kontrollverdau mit NotI bzw.EcoRI (1,5ml) Agarosegelelektrophorese mit Verdau-Ansatz+unverdauten Ansatz 2 Banden im verdauten Ansatz (Vektor+Fragment) Sequenzierung durch GATC (mind.1-2 Klone mit gewünschtem Fragment; 30µl Plasmid-DNA (100ng/µl) GVO (genet.veränderter Organismus) von allen Klonen, die laut Sequenzierung gewünschtes Fragment enthalten (ca.2) V37 V42 V41 Blue-White-Screening Inkubation ÜN bei 37°C in Schütteltruhe bei 300rpm Nachzucht Klon mit gewünschtem Fragment (0,5ml) 0,5ml Baktriensuspension+2 0der 4ml LB-Medium Inkubation ÜN (auf diese Art immer wieder mgl.Klone hochzuzüchten) Falls Menge des Plasmidpräp nicht ausreichend

4 Beschichtung LightCycler-Kapillaren (Roboscreen) Quantitative PCR m.Light Cycler


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