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MIN – Untersuchungen beim sporadischen Nierenzellkarzinom Zwischenergebnisse Was ist Mikrosatelliteninstabilität (MIN) ? Was ist Alu/AP - PCR ? Methoden/

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Präsentation zum Thema: "MIN – Untersuchungen beim sporadischen Nierenzellkarzinom Zwischenergebnisse Was ist Mikrosatelliteninstabilität (MIN) ? Was ist Alu/AP - PCR ? Methoden/"—  Präsentation transkript:

1 MIN – Untersuchungen beim sporadischen Nierenzellkarzinom Zwischenergebnisse Was ist Mikrosatelliteninstabilität (MIN) ? Was ist Alu/AP - PCR ? Methoden/ Materialien Ergebnisse Ausblicke

2 Was ist Mikrosatelliteninstabilität ( MIN ) ? Mikrosatelliten: kurze polymorphe Tandemrepeats,1% des Genoms Mono-,Di-,Tri-,Tetra - Nukleotidsequenzen Kopien von 1-6 Basenpaarmotiven ( Cunningham et al. IOS Press, 1999 ) treten ungefähr aller Basenpaaren einmal auf fungieren vermutlich als Promotoren, Bindungsstellen für Topoisomerasen Relativ konstant übers Genom verteilt, zu 90 % heterozygot, Brauch et al. Vorwiegend in intronischen DNA - Abschnitten gelegen Längenveränderungen dieser DNA – Abschnitte (MIN/ Replication Error Phänotyp) verweisen auf genetische Instabilität Expansionen/ Kontraktionen während Replikation

3 Replikation Expansion Kontraktion Fehlpaarungen (Mismatches) Fehlpaarungen (Mismatches)

4 Historie von MIN MIN wird ursprünglich 1993 beim HNPCC - Syndrom (hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom) beschrieben (Aaltonen et al. Science 260; Ionov et al.Nature 363, Thibodeau et al. Science 260) HNPCC assoziierte Tumore weisen zu % MIN auf Physiologisches Auftreten von Fehlpaarungen (Mismatches) im Bereich einfach - repetitiver Sequenzen während der DNA - Replikation bei Bakterien/ Hefen Mismatch-Reparaturenzyme korrigieren Replikationsfehler 6 DNA - (mismatch) Reparaturgene hMSH2 3 homolog zum bakteriellen MutS: hMSH2, hMSH3, hMSH6 hMLH1 3 homolog zum bakteriellen MutL: hMLH1, hPMS1, hPMS2

5 Historie von MIN hMSH Klonierung des ersten Mismatch-Repairgen hMSH2 ( Fishel et al) aus Kolonkarzinom - DNA Keimbahnmutation ist wesentlicher Faktor für HNPCC - Syndrom Voraussetzung für MIN - positive Karzinome ist Inaktivierung beider Allele eines Mismatch-Repairgens ( two – hit Modell nach Knudson, PNAS 68 ) Diagnostik bei HNPCC mittels MIN - Analyse mit immunhistochemischer Repairgen - Expressionsbestimmung (anti - hMSH2, anti - hMLH1 am Tumor) : positiv Sequenzierung von hMSH2, hMLH1 in Normal - DNA 5 Mikrosatelliten: BAT 25, BAT 26, D5S346, D17S250, D2S123

6 MIN in Nicht - HNPCC assoziierten sporadischen Tumoren Modifiziert nach Cunnigham et al. IOS Press 1999

7 AP - PCR: Unterschied zu gewöhnlicher PCR: Generierung einer reproduzierbaren Schar von Produkten (genomischer DNA- Fingerabdruck) mit einem Primer Voraussetzung: Alu- Verdau, ~ 450 bp große Fragmente Alu Alu - Sequenz: 5% des Genoms, assoziiert mit % bestimmter Mikrosatelitten am 3 Ende auf Alu somatische Mutationen von Di- und Trinukleotiden treten mit veränderten Alu - Sequenzen auf Sood und Buller (Oncogene 13): 36 von 68 Ovarialtumoren mit MIN weisen veränderte Alu/ AP - PCR Bandenmuster Methoden und Materialien Blut - DNA

8 Methoden und Materialien Ablauf: DNA - Isolation aus Gefriermaterial mittels Salzextraktion (Tumor-, Normalgewebe) Konzentrationsmessung a) 20 ng - Verdünnung für Mikrosatelitten - PCR b) DNA - Verdau mit ALU 1 für AP - PCR c) Kontrolle der PCR - Produkte im Agarose - Gel Denaturierung mittels Hitze und Formamid - Puffer Auftragen der PCR - Produkte auf PAA - Gel mit anschließender Silberfärbung Vergleich des Bandenmusters von Normal- und Tumorgewebe Probleme:nach absoluten Schwierigkeiten mit AP - PCR muß diese für die ersten 100 Patienten abgearbeitet werden

9 Methoden und Materialien Einsatz von 6 Mikrosatellitenmarkern: Christian Höfling:Christian Höfling: Christian Höfling:Christian Höfling: Dietmaier et al. Cancer Res 57, 1997

10 40 Patienten mit 5 Markern untersucht BAT 25, Bat 26, REN, MYCL1, tp53Alu (RB wird optimiert) Patient 13 und 40 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig ab Patient 41 nur noch: REN, MYCL1, tp53Alu 100 Patienten mit MYCL1 und tp53Alu untersucht nur noch Patient 41 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig (REN steht bei Patient 72) AP – PCR: PCR klappt nach größeren Problemen Auftragen der Proben auf PAA – Gelzeigt erwartetes Ergebnis Ergebnisse

11 Ergebnisse MIN bei Pat. 13, 40, 41 auffällige Marker: tp53Alu MYCL 1 Vergleich +/ - MIN bei Pat.13/ 14 LOH MYCL1 T 13N 13T 14N 14 Expansion

12 Ergebnisse tp53ALU T 41N 41 MYCL1 T 41N 41 LOH AP - PCR N 13T 13 shift

13 Ergebnisse sensitiver Nachweis von gemischten DNA - Mengen möglich (schwache PCR - Produkte sind nicht kritisch für MIN - Nachweis) Verdünnungsreihe der PCR - Produkte für tp53Alu (µl PCR - Produkt zur Fällung) ,5 100 bp Leiter Standards 63 ng 125 ng 250 ng 500 ng 750 ng T 40 N 40 von 50 µl Gesamtansatz 10 µl auf Agarosegel 10 µl auf PAA - Gel

14 Einsatz eines alten PCR - Produktes als Template in neue AP - PCR altes PCR - Produkt wurde verdünnt: 1:101: 501: 00 jeweils 2 µl von Verdünnung eingesetzt Resultat: reproduzierbares Bandenmuster unabhängig von Templatemenge stabile Nachweismethode genetischer Instabilität Ergebnisse 1:10 1:50 1:100

15 Ausblicke Verwendung neuer Marker im Bereich von Tumorsuppressorgenen des Chromosoms 3: 2 Marker der VHL - Region D3S1560, D3S Marker der FHiT - Region D3S1300, D3S4260

16 Ausblicke Auskunft über postoperative klinische Daten Rückantwortbrief an niedergelassenen Urologen/ Hausarzt (Korrelation zw. Patientenkarriere und MIN ?) Immunhistochemie der Mismatch - Reparaturenzyme Zusammenarbeit mit Thomas mRNA - Expressionsprofile: Wahrscheinlichkeit einer umfassenden genomischen Instabilität von bekannten Markern Ende 2002 anvisiertes Ende der Experimente: Ende 2002


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