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Evaluierung und Validierung potenzieller molekulargenetischer Tumormarker in Urinproben von Patienten mit Verdacht auf Harnblasenkarzinom Labor-Seminar08.04.2008.

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1 Evaluierung und Validierung potenzieller molekulargenetischer Tumormarker in Urinproben von Patienten mit Verdacht auf Harnblasenkarzinom Labor-Seminar Juliane Schmidt Und ganz viele Helfer!

2 Einführung Epidemologie BCa:Epidemologie BCa: Vierthäufigster Tumor beim Mann weltweit neunthäufigste Ursache eines tumorbedingten Todes Vierthäufigster Tumor beim Mann weltweit neunthäufigste Ursache eines tumorbedingten Todes Diagnostik:Diagnostik: A) nicht-invasiv: B) invasiv: 1. Allgemein: 1.Speziell: UrinsedimentUrinsediment UrincytologieUrincytologie ZystoskopieZystoskopie SonographieSonographie

3 Zielstellung Etablierung standardisierter Methoden zur quantitativen Transkriptmessung in Geweben (TUR-Späne) und UrinprobenEtablierung standardisierter Methoden zur quantitativen Transkriptmessung in Geweben (TUR-Späne) und Urinproben Targetvalidierung an Gewebeproben (Tu-Tf)Targetvalidierung an Gewebeproben (Tu-Tf) Evaluierung verschiedener tumorassoziierter Faktoren als mögliche diagnostische und prognostische BCa-MarkerEvaluierung verschiedener tumorassoziierter Faktoren als mögliche diagnostische und prognostische BCa-Marker

4 BCa-assoziierte Gene Survivin & XIAP (inhibitor of apoptosis proteins)Survivin & XIAP (inhibitor of apoptosis proteins) Ki67Ki67 NEU NEU CK20CK20 UCA1UCA1 hTERThTERT

5 Material & Methoden 1 prospektive Studie: Februar 2006 – März 2007 (letzter Primärurin)prospektive Studie: Februar 2006 – März 2007 (letzter Primärurin) Einschlusskriterien:Einschlusskriterien: –Patienten mit Verdacht auf ein BCa, die sich einer transurethralen Resektion (TUR-BT) unterziehen Ausschlusskriterien:Ausschlusskriterien: –Patienten mit zusätzlichem Prostata-Ca –Patienten mit gutartigen Veränderungen ( z.B.Papillom ) –Patienten mit nicht-urothelialen Karzinomen (z.B.Adeno-Ca)

6 Material & Methoden 2 Kontrollgruppen:Kontrollgruppen: –BPH-Patienten –Cystitis-Patienten –Gesunde

7 Material & Methoden 3 BCa-Patienten:BCa-Patienten: –prä-operative Urinprobe –intra-operatives Gewebe (Tumor & optisch gesunde Blasenmucosa) –post-operative Urinprobe (bis 11/06) für prim./sek./tert. TUR-BT/ Rezidive/ Cystektomie für prim./sek./tert. TUR-BT/ Rezidive/ Cystektomie Kontrollen: 1 UrinprobeKontrollen: 1 Urinprobe

8 Behandlungsverlauf eines Blasenkarzinompatienten Primäre TURBT Cystektomie Sekundäre TURBT Tertiäre TURBT Cystektomie ca. 6-8 Wochen Rezidiv

9 Material & Methoden 4 Sedimentation der Zellen aus dem UrinSedimentation der Zellen aus dem Urin Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = %)Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = %) Isolation von total RNA und cDNA-SyntheseIsolation von total RNA und cDNA-Synthese quantitative PCR für Bca-Gene und das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeprobenquantitative PCR für Bca-Gene und das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeproben Korrelation der relative Expressionsniveaus von der BCa-Gene (interne Normalisierung auf TBP) mit klinisch-pathologischen AspektenKorrelation der relative Expressionsniveaus von der BCa-Gene (interne Normalisierung auf TBP) mit klinisch-pathologischen Aspekten

10 BCa vs.Kontrollgruppen group BCa BPHcystitishealthy BTNT n105 (85,37%) 18 (14,63%) age * 71J. (22-93J.) 67,5J. (62-87) 32,5J. (18-88J.) 29J. (18-59) m:f72:50 (59:41%) 1:24 (4:96%) 16:30 (34,8:65,2%) PSA * ng/ml 1,56 (0-33,91) 2,4 (0, ) *Mediane angegeben

11 TNM vs. Risk groups TNMGradingRisk group (eau) pT0 17 (13,9%) NT 17 (13,9%) NT 17 (13,9%) pTis 1 (0,8%) G1 Low grade 29 (23,8%) Low risk 29 (23,8%) pTa 60 (49,2%) G2 High grade 76 (62,3%) Intermediate risk 26 (21,3%) pT1 18 (14,8%) G3High risk 50 (41%) >pT1 26 (21,3%)

12 Risikogruppen (eau guidelines) bzgl. Rezidiv+ Progression Low-Risk Tumor Solitärer, kleiner (< 3 cm), low-grade/G1, Ta-Tumor ohne CIS High-Risk Tumor T1, high-grade/G3-Tumor, multifokal oder rezidivierend ± CIS Intermediate-Risk Alle anderen Tumoren (Ta-1, G1-2, multifokal > 3 cm)

13 Cytologie 42,9%100% 81,4% Negativ prädiktiver Wert (npW) Positiv prädiktiver Wert (ppW) SpezifitätSensitivität

14 Ergebnisse 1 2 Referenzgene getestet: TBP besser als HPRT2 Referenzgene getestet: TBP besser als HPRT Urinproben: negative Korrelation zw. Referenzgen- Expression & Erythrozyten / LeukozytenUrinproben: negative Korrelation zw. Referenzgen- Expression & Erythrozyten / Leukozyten viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze von 10 Transkriptmolekülen von 10 Transkriptmolekülen Gewebeproben: weniger Proben mit neg. ReferenzgenGewebeproben: weniger Proben mit neg. Referenzgen aufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Geneaufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Gene

15 Statistik Gewebe gepaart (n=41) Ki67XIAPSVVhTERTCK20UCA1 Tumor (Tu) Median 3,6017,741,77,1014,0911,77 Min,002,63,05,00 Max 41,29526,5022,253,89261,36209,44 Tumorfrei (Tf) Median 2,8417,00,93,0017,501,38 Min,005,45,05,00,16 Max 37,74214,2711,553,56261,36125,63 p (Wilcoxon),799,518,557,203,181,009 Signifikanz: p<0,05

16 Ki67/TBP in ungepaarten Gewebeproben

17 XIAP/TBP in gepaarten Gewebeproben

18 SVV/TBP in gepaarten Gewebeproben

19 hTERT/TBP in gepaarten Gewebeproben

20 CK20/TBP in gepaarten Gewebeproben

21 UCA1/TBP in gepaarten Gewebeproben

22 Ki67/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen Gesunde: fehlende Werte Null gesetzt

23 XIAP/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

24 SVV/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

25 CK20/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

26 UCA1/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

27 Ki67/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

28 XIAP/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

29 SVV/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

30 CK20/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

31 UCA1/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

32 Statistik BCa vs. Controls Ki67XIAPSVVCK20 P (Wilcoxon)4,45E-0092,83E-0051,43E-0124,58E-008 Signifikanz: P<0,05

33 Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

34 XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

35 SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

36 CK20/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

37 UCA1/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

38 Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

39 XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

40 SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

41 CK20/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

42 UCA1/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

43 Ki67/TBP im Urin vs.risk group

44 XIAP/TBP im Urin vs.risk group

45 SVV/TBP im Urin vs.risk group

46 CK20/TBP im Urin vs.risk group

47 UCA1/TBP im Urin vs.risk group

48

49 Schlussfolgerungen Eignung als Tumormarker: CK20, Ki67 (UCA1 CAVE: Fallzahl)Eignung als Tumormarker: CK20, Ki67 (UCA1 CAVE: Fallzahl). Vgl Bca-Kontollen alle Gene hochsignifikant Abhängigkeit vom TumorstadiumAbhängigkeit vom Tumorstadium Abhängigkeit vom TumorgradAbhängigkeit vom Tumorgrad Einteilung in risk groups sinnvollEinteilung in risk groups sinnvoll XIAP ungeeignet: Expression im Prostata-XIAP ungeeignet: Expression im Prostata- gewebe => bei BPH gewebe => bei BPH Expression in Leukozyten Expression in Leukozyten => bei Cystitis => bei Cystitis

50 Ausblick Kontinuierliches Follow-up (Zusammenhang Markererhöhung-Rezidivhäufigkeit?)Kontinuierliches Follow-up (Zusammenhang Markererhöhung-Rezidivhäufigkeit?) Kombination der Tumormarker (Modell? Prostata- Krebs-Studie)Kombination der Tumormarker (Modell? Prostata- Krebs-Studie) Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?) Nachsammlung von Urinzytologie läuft bereits (DANKE!!!)Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?) Nachsammlung von Urinzytologie läuft bereits (DANKE!!!) Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH )Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH )


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