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Evaluierung und Validierung potenzieller molekulargenetischer Tumormarker in Urinproben von Patienten mit Verdacht auf Harnblasenkarzinom Labor-Seminar07.02.2007.

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1 Evaluierung und Validierung potenzieller molekulargenetischer Tumormarker in Urinproben von Patienten mit Verdacht auf Harnblasenkarzinom Labor-Seminar Juliane Schmidt Und ganz viele Helfer!

2 Einführung Harnblasenkarzinom (BCa)Harnblasenkarzinom (BCa) Vierthäufigster Tumor beim Mann weltweit & neunthäufigste Ursache eines tumorbedingten Todes Vierthäufigster Tumor beim Mann weltweit & neunthäufigste Ursache eines tumorbedingten Todes Zystoskopie (invasiv) & Urinzytologie:Zystoskopie (invasiv) & Urinzytologie: Standardmethoden zur Diagnose und Überwachung Standardmethoden zur Diagnose und Überwachung kein idealer BCa-Tumormarker zur nichtinvasiven Diangostikkein idealer BCa-Tumormarker zur nichtinvasiven Diangostik

3 Zielstellung Etablierung standardisierter Methoden zur quantitativen Transkriptmessung in Geweben (TUR-Späne) und UrinprobenEtablierung standardisierter Methoden zur quantitativen Transkriptmessung in Geweben (TUR-Späne) und Urinproben Targetvalidierung an Gewebeproben (Tu-Tf)Targetvalidierung an Gewebeproben (Tu-Tf) Evaluierung verschiedener tumorassoziierter Faktoren (Survivin, XIAP, Ki67) als mögliche diagnostische und prognostische BCa-MarkerEvaluierung verschiedener tumorassoziierter Faktoren (Survivin, XIAP, Ki67) als mögliche diagnostische und prognostische BCa-Marker

4 BCa-assoziierte Gene Survivin & XIAP: inhibitor of apoptosis proteins (IAP)Survivin & XIAP: inhibitor of apoptosis proteins (IAP) Ki67: Proliferationsmarker, essential für ZellzyklusKi67: Proliferationsmarker, essential für Zellzyklus selektiv überexprimiert in vielen Tumorarten inkl. BCaselektiv überexprimiert in vielen Tumorarten inkl. BCa Assoziation zwischen Überexpression und höherem Tumorstadium & Grad sowie mit ungünstiger PrognoseAssoziation zwischen Überexpression und höherem Tumorstadium & Grad sowie mit ungünstiger Prognose ( SVV+Ki67 ) ( SVV+Ki67 ) geeignete Marker (Literatur: Gewebe und Urin) und therapeutische Targets für Antitumortherapien (z.B. Antisense- Studie)geeignete Marker (Literatur: Gewebe und Urin) und therapeutische Targets für Antitumortherapien (z.B. Antisense- Studie)

5 Material & Methoden 1 prospektive Studie: Februar 2006 – Januar 2007prospektive Studie: Februar 2006 – Januar 2007 Einschlusskriterien:Einschlusskriterien: –Patienten mit Verdacht auf ein BCa (Neudiagnose oder Rezidiv) die sich einer transurethralen Resektion (TUR-BT) unterziehen Ausschlusskriterien:Ausschlusskriterien: –Patienten mit zusätzlichem Prostata-Ca –Patienten mit gutartigen Veränderungen ( z.B.Papillom ) –Patienten mit nicht-urothelialen Karzinomen (z.B.Adeno-Ca)

6 Material & Methoden 2 Kontrollgruppen:Kontrollgruppen: –BPH-Patienten –Cystitis-Patienten –Gesunde –Cystektomiepatienten ( Sammlung läuft noch )

7 Material & Methoden 3 BCa-Patienten:BCa-Patienten: –prä-operative Urinprobe –intra-operatives Gewebe (Tumor & scheinbar normale Blasenmucosa) –post-operative Urinprobe (Sammlung ge- stoppt) stoppt) für jede TUR-BT (prim./sek./tert., aller 4-6 Wo.) für jede TUR-BT (prim./sek./tert., aller 4-6 Wo.) gleicher Zyklus auch bei Rezidiven gleicher Zyklus auch bei Rezidiven Kontrollen: 1 UrinprobeKontrollen: 1 Urinprobe

8 Behandlungsverlauf eines Blasenkarzinompatienten Primäre TURBT Cystektomie Sekundäre TURBT Tertiäre TURBT Cystektomie ca. 6-8 Wochen Rezidiv

9 Material & Methoden 4 Sedimentation der Zellen aus dem UrinSedimentation der Zellen aus dem Urin Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = %)Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = %) Isolation von total RNA und cDNA-SyntheseIsolation von total RNA und cDNA-Synthese quantitative PCR für Survivin, XIAP & Ki67 und das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeprobenquantitative PCR für Survivin, XIAP & Ki67 und das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeproben Korrelation der relative Expressionsniveaus von Survivin, XIAP & Ki76 (interne Normalisierung auf TBP) mit klinisch-pathologischen AspektenKorrelation der relative Expressionsniveaus von Survivin, XIAP & Ki76 (interne Normalisierung auf TBP) mit klinisch-pathologischen Aspekten

10 Bca-Patienten (N=106) BT= 89 ( 84% ) NT= 17 ( 16% )BT= 89 ( 84% ) NT= 17 ( 16% ) Alter (median) = 70 Jahre (34 – 93)Alter (median) = 70 Jahre (34 – 93) M:F = 63 : 43 (59,4% : 40,6%)M:F = 63 : 43 (59,4% : 40,6%) Neudiagnose : Rezidiv = 92 : 14 (86,8% : 13,2%)Neudiagnose : Rezidiv = 92 : 14 (86,8% : 13,2%) PSA (median; 58 Pat.) = 1,195 (0,16 – 33,91)PSA (median; 58 Pat.) = 1,195 (0,16 – 33,91) Tumorstadien: NT= kein Tumor nachweisbar n=17 pTa n=56 pT1 n=15 >PT1 n=17Tumorstadien: NT= kein Tumor nachweisbar n=17 pTa n=56 pT1 n=15 >PT1 n=17 NA n=1 NA n=1 cis:92 :14 (86,6% : 13,2%) cis:92 :14 (86,6% : 13,2%) Tumorgrade: NT n=17Tumorgrade: NT n=17 LMP (low malignancy potential) n=6 LMP (low malignancy potential) n=6 low grade n=17 high grade n=66

11 Kontrollen n =34 67,5 Jahre (52-85J.) BPH: n =34 67,5 Jahre (52-85J.) PSA-Median 2,105ng/ml PSA-Median 2,105ng/ml (0,28-21,58) (0,28-21,58) Cystitis: n =6 49,5 Jahre (19-76J.) Cystitis: n =6 49,5 Jahre (19-76J.) M : F = 1:5 M : F = 1:5 Gesunde: n =30 30 Jahre (18-59J.) Gesunde: n =30 30 Jahre (18-59J.) M : F=7:22 M : F=7:22

12 Cytologie 36%92%75%78% Negativ prädiktiver Wert (npW) Positiv prädiktiver Wert (ppW) SpezifitätSensitivität Vergleich mit unseren Daten folgt

13 Ergebnisse 1 2 Referenzgene getestet: TBP besser als HPRT2 Referenzgene getestet: TBP besser als HPRT Urinproben: negative Korrelation zw. Referenzgen- Expression & Erythrozyten / LeukozytenUrinproben: negative Korrelation zw. Referenzgen- Expression & Erythrozyten / Leukozyten viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze von 10 Transkriptmolekülen von 10 Transkriptmolekülen Gewebeproben: weniger Proben mit neg. ReferenzgenGewebeproben: weniger Proben mit neg. Referenzgen aufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Geneaufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Gene

14 Ki67/TBP in ungepaarten Gewebeproben

15 XIAP/TBP in ungepaarten Gewebeproben

16 SVV/TBP in ungepaarten Gewebeproben

17 Ki67/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen Gesunde: fehlende Werte Null gesetzt

18 XIAP/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

19 SVV/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

20 Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

21 XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

22 SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

23 Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

24 XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

25 SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

26 Schlussfolgerungen Eignung als Tumormarker: Ki67,(SVV)Eignung als Tumormarker: Ki67,(SVV) Abhängigkeit vom Tumorstadium: Ki67,SVVAbhängigkeit vom Tumorstadium: Ki67,SVV Abhängigkeit vom Tumorgrad: Ki67,(SVV)Abhängigkeit vom Tumorgrad: Ki67,(SVV) XIAP ungeeignet: Expression im Prostata-XIAP ungeeignet: Expression im Prostata- gewebe => bei BPH gewebe => bei BPH Expression in Leukozyten Expression in Leukozyten => bei Cystitis => bei Cystitis

27 Ausblick 1 gezielte Nachbeobachtung von Patienten ohne histologischen Tumornachweis (NT)gezielte Nachbeobachtung von Patienten ohne histologischen Tumornachweis (NT) Abfall der Tumormarker nach der primären TUR-BT?Abfall der Tumormarker nach der primären TUR-BT? Statistische Signifikanz: möglich durch Kombination der Tumormarker ? (Verweis auf Prostata-Krebs-Studie)Statistische Signifikanz: möglich durch Kombination der Tumormarker ? (Verweis auf Prostata-Krebs-Studie) Ausweitung der Tumorgene ( z.B. hTERT,CK20 )Ausweitung der Tumorgene ( z.B. hTERT,CK20 ) Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?)Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?)

28 Ausblick 2 Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH )Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH ) Korrelation Tumormarker im Urin und korrespondierenden GewebeKorrelation Tumormarker im Urin und korrespondierenden Gewebe Ausschlusskriterium Harnwegsinfekt:Ausschlusskriterium Harnwegsinfekt: Bakterienzahl oder positive Urinkultur? Bakterienzahl oder positive Urinkultur? Sammlung BPH-,Cystitis-und Cystektomie- PatientenSammlung BPH-,Cystitis-und Cystektomie- Patienten Abschätzung der Rezidivhäufigkeit?Abschätzung der Rezidivhäufigkeit?


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