MIKROSATELLITENANALYSEN IM BEREICH EINES PUTATIVEN TUMORSUPPRESSORGENS AUF CHROMOSOM 13 BEIM PROSTATAKARZINOM W. Ehlers, U. Fiedler, U. Schmidt, G. Faller*,

Präsentation zum Thema: "MIKROSATELLITENANALYSEN IM BEREICH EINES PUTATIVEN TUMORSUPPRESSORGENS AUF CHROMOSOM 13 BEIM PROSTATAKARZINOM W. Ehlers, U. Fiedler, U. Schmidt, G. Faller*,"—  Präsentation transkript:

1 MIKROSATELLITENANALYSEN IM BEREICH EINES PUTATIVEN TUMORSUPPRESSORGENS AUF CHROMOSOM 13 BEIM PROSTATAKARZINOM W. Ehlers, U. Fiedler, U. Schmidt, G. Faller*, M. P. Wirth Klinik und Poliklinik für Urologie der TU Dresden, *Institut für Pathologie der Universität Erlangen ZUSAMMENFASSUNG Mittels LOH-Analysen wurde die tatsächliche Bedeutung des von uns neu identifizierten Gens C13, welches einen Kandidaten für ein putatives Tumorsuppresorgen beim Prostatakarzinom darstellt, evaluiert. Das C13- Gen befindet sich auf Chromosom 13q13 zwischen den bereits bekannten Tumorsuppressorgenen BRCA2 und Rb1. In unseren LOH- Untersuchungen konnten wir feststellen, daß der Bereich von C13 in 55% der PCa-Patienten deletiert ist. Dies spricht für eine Bedeutung des C13 Gens in der Prostata-Karzinogenese. MATERIAL UND METHODEN Isolierung genomischer DNA Genomische DNA wurde aus pathologisch begutachteten Paraffinschnit- ten von tumorhaltigem und tumorfreiem Prostatagwebe sowie aus Blut isoliert. Es wurden nur Tumorgewebe mit einem Anteil von min-destens 60% Tumorzellen bzw. tumorfreies Gewebe ohen Tumorzellen für die Analysen verwendet. Die DNA-Extraktion aus den Geweben erfolgte nach einer Xylolbehandlung der Paraffinschnitte und einer anschließen- den Aufnahme in DNA-Puffer (50 mM Tris, pH 8,5; 1 mM EDTA; 0,5% Tween 20) und einer Proteinase K-Behandlung. Die nach der Inaktivie- rung der Proteinase erhaltene DNA-Lösung wurde direkt für die nach- folgenden PCr-Reaktionen eingesetzt. DNA aus Blut wurde mit der Salz- extraktionsmethode nach Lahiri und Nürnberger (1991) isoliert. LOH-Analysen Für die LOH-Analysen im Bereich von 13q13 wurden die Marker D13S894, D13S1491, D13S1253, D13S765 und D13S1227 verwendet, wobei jeweils ein Primer mit Texas Red markiert war. In den PCR-Reaktionen wurden ca. 200-300 ng Gewebe-DNA bzw. 50- 100 ng Blut-DNA eingesetzt. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Vo- lumen von 25 µl nach dem folgenden Regime durchgeführt: 95°C - 3 min; 35 Zyklen Amplifikation: 95°C - 1 min, 60°C - 40 sek, 72°C - 1 min; Polymerasereaktion: 72°C - 5 min. Die PCR-Produkte wurden in einem 6% igen Gel aufgetrennt. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit der Software des Vistra-DNA Sequenzers (Amersham). Eine allelische Imbalance wurde mit 10-30% igen Unterschied in der Peakhöhe zwischen Tumor und tumorfreiem Gewebe und ein LOH mit einem Unterschied von mehr als 30% definiert. DISKUSSION ERGEBNISSE PROBLEMSTELLUNG Die LOH-Analysen wurden mit DNA von 21 Prostatakarzinompatienten mit 5 Mikrosatelli- tenmarkern im Bereich von C13 (13q13) durch- geführt. 13 der 21 Patienten zeigten (61%) zeig- ten einen LOH (loss of heterozygosity) oder eine AI (allelic imbalance) bei einem oder mehreren der getesteten Loci (Abb.1). Bei der Entstehung des Prostatakarzinms spielen sowohl Tumorsuppressorgene als auch Onkogene eine entschiednede Rolle. Im rahemen einer differentiellen genexpressionsanalyse wurde von uns eine Kandidatengen C13 isoleirt, dessen mRNA im Tumorgewebe unterrepräsentiert ist. Dieses potentielle Tumorsupressoregen sollte hinsichtlich seiner tatsächlichehn invilvierung in die Entstehnmg des prostatakarzinoms anhand von Mikrosatellitenanaylsen unterscuht werden. Dazu wurde in dem frgalichen bwerich der Lokaliusation von C13 5 verschiednen Mikrosatellitenmarker ausgescuht, mit dnene eine LOH-Analyse mit Tumor, tumorfreine gewebe und Patrienteblut durchgeführt werden sollte. Da in der region des putativen Tumorsupressorgens weitere andere TSG wie BRCA2 und RB1 vorkommen und weitere noch nicht identifizierte TSGs vermutet werden, war die Analyse des defür C13 definierten bereiches wichtig. Mittels Differentieller Display Analysen wurde das cDNA-Fragment C13 isoliert, welches bei 3 von 5 Prostatakarzinom Patienten unter- repräsentiert ist. Das korrespondierenden Gens wurde auf Chromosom 13q13 zwischen den bereits bekannten Tumorsuppressorgenen BRCA2 und RB1 lokalisiert. Unsere Vermutung, daß es sich dabei um ein neues Tumorsuppressorgen handelt, wird durch die Ergebnisse der durchge- führten LOH-Analysen verstärkt. In diesem Bereich von 13q13 wuren bei 57 % der Patienten chromosomale Alterationen Deletionen im Tumorgewebe nachgewiesen. Chromosomale Abberationen von 13q sind beim Prostatakarzinom häufig beschrieben worden. Diese Region enthält die beiden bekannte Tumorsuppressorgege BRCA2 und Rb1 - Regionen, häufigen Allelverlustes bei Tumoren. Chromosomale Deletionen in diesen Regionen korrelieren jedoch meist nicht mit der Proteinexpression der Gene. Es wird deshalb vermutet, daß in diesem Bereich weitere Tumrosuppressorgene, die auch bei der Entwicklung des Prostata- karzinoms eine Rolle spielen könnten, vorhanden sind. Unsere Daten unterstützen die Hypothese, daß sich in diesem Beriech weitere Tumorsuppressorgene befindedn. Der Nachweis von DNA-Verlusten im Bereich des von uns identifizierten neuen putativen Tumorsuppressorgens C13 bei mehr als 55% der untersuchten Patienten unterstützt die Hypothese, daß C13 in die Tumorgenese des Prostatakarzinoms involviert zu sein scheint. Eine Bestätigung der Daten soll mittels Loh-Anylsen an mikrodisseziertem Material durchgeführt werden. Zur Abgrenzung gegenüber BRCA2 und RB1 werden z.Z. Analysen mit weiteren Markern durchgeführt. SCHLUSSFOLGERUNG Tabelle 1: Übersicht der erhaltenen LOH Ergebnisse bei Testung von 5 Mikrosatellitenmarkern im Bereich von 13q13. LOH - loss of heterozygosity AI - allelic imbalance Die am häufigesten veränderte Region (bei 57% der Heterozygoten) wurde im Bereich des Markers D13S 1491 fest-gestellt (Tab.1). Von den 21 untersuchten Patienten zeigten 6 einen LOH bei mindestens einem der getesteten Loci. Vier dieser 6 zeigten einen LOH bei dem Marker D13S1491, drei bei dem Marker D13S765 und weitere drei bei D13S1227.