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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien Doreen Kunze 21.07.05 Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften.

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1 Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien Doreen Kunze Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden

2 Einleitung häufigste Krebserkrankung bei Männern zweithäufigste Krebs-Todesursache Lebenszeitrisiko: –zu erkranken: 9,6 % –zu sterben: 3,2 % Häufigkeitsgipfel zwischen 70. – 75. Lebensjahr genetisch und tumorbiologisch sehr heterogen 2 Prostatakarzinom (PCa)

3 Einleitung 3 Tumorentwicklung Überexpression von Onkogenen und/oder funktionelle Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG) PCa: –Onkogene:Progression –TSG:Entstehung häufig Allelverluste (LOH – loss of heterozygosity) auf den Chromosomen- abschnitten 8p und 13q

4 Einleitung P38IP (C13orf19, FAM48A) lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei TSG LOH-Ereignisse mRNA-Expression in primären PCa reduziert Chromosom RB1 C 13 BRCA2 Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression ? 4

5 Einleitung siRNA (small interfering RNA) 5 Zellkern Target-mRNA Target-Gen polyA Sequenzspezifisches Gensilencing Target-mRNA- Spaltung Aktivierter RISC ATP ADP + P i zelluläre Kinase RISC Bildung von RISC siRNA-Entwindung Anlagerung von RISC an Target-mRNA siRNA modifiziert nach D. Bauer Bestandteil der RNA- Interferenz posttranskriptionelle Geninhibierung 2 nt-3`-Überhänge antisense-Strang aktiviert RISC (RNA induced silencing complex) Hydrolyse komplementärer mRNA

6 1.Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene ? 2.Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK ? 3.Androgenabhängigkeit der P38IP-mRNA- Expression ? 6 Ziele

7 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition h nach TF- Start siRNA-D1 ( nt) siRNA-D2 ( nt) siRNA-D3 ( nt) siRNA-D4 ( nt) siRNA-D5 ( nt) 1242 %49 %22 %55 %12 % 2450 %58 %40 %56 %16 % 4845 % 32 %67 %23 % 7256 %50 %36 %93 %31 % Aussaat (PC-3, BPH-1) siRNA-Transfektion ( nM, 4 h) 24 – 72 h WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest 20 – 68 h Zeitabhängige Inhibierung der P38IP-mRNA- Expression in PC-3-Zellen: effektive, langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression P38IP-mRNA-Expression/PBGD, normiert auf ns-siRNA; Klammerausdruck: Position des sense-Stranges der siRNA auf der P38IP-mRNA (3077 nt) 7

8 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition Zellkoloniebildungstest WST-1-Test keine Kurzzeit- proliferations- veränderungen 8 keine Langzeit- proliferations- effekte

9 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition Zellzyklusverteilung keine Zellzyklus- veränderungen 9 unbehandelt siRNA-D5 5,5 % ns-siRNA 4,9 %4,3 % Apoptosemessung (FACS) - 48 h keine Veränderung der Apoptoserate

10 1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h) Aussaat (PC-3) siRNA-Transfektion (250 nM, 4 h) 24 – 72 h20 h WST-1-Test Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest 24 – 72 h Zellzahlreduktion infolge CT-Behandlung keine Kombinations- effekte keine Apoptoseinduktion 10

11 1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT 125fache Vergrößerung A: PC-3 siRNA-D5 B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid Vergrößerung der Zellen infolge des G 2 /M-Arrestes Zellzyklusverteilung 11 CT-vermittelter Zellzyklusarrest

12 effektive und langanhaltende Geninhibition durch siRNA P38IP hat keinen Einfluss auf das Wachstum der untersuchten Prostatazelllinien verminderte Expression nicht ursächlich mit PCa- Entstehung verbunden möglicherweise mit Progression der Karzinome assoziiert oder Begleiterscheinung der zunehmenden genetischen Instabilität auf dem Chromosom 13q 12 Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene Zusammenfassung 1.Teil

13 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK P38IP = p38MAPK interacting protein MAPK = mitogenaktivierte Proteinkinase intrazelluläre Signalübertragung (Proteinkinasen-Kaskaden) stressaktiviert 4 Isoformen (α, β, γ, δ) SB inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle Quelle: 13

14 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK Inhibition der p38MAPK durch SB P38IP-mRNA-Expression Inhibition der P38IP- mRNA-Expression mit siRNA-D5 Expression und Phosphorylierungsstatus der p38MAPK 14

15 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK Expression & Phosphorylierungsstatus der p38MAPK unverändert 1. Inhibition von P38IP mit siRNA-D5 15 phospho-p38MAPK β-Actin p38MAPK (gesamt) siRNA-D5 unbehandelt ns-siRNA siRNA-D5 ns-siRNA siRNA-D5 Marker PC-3 Erntezeitpunkt nach Transfektion: 72 h96 h72 h

16 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse) kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK 2. Inhibition der p38MAPK mit SB

17 3. Androgenabhängigkeit P38IP-mRNA-Expression ist nicht androgenabhängig Aussaat (LNCaP) Hormonfreies Medium 24 h 3 – 48 h Androgen R1881 (+ Bicalutamid) 24 h RNA-Isolierung + qPCR 17

18 Zusammenfassung 18 1.P38IP besitzt keine Tumorsuppressor- funktion in den untersuchten Zelllinien 2.Kein Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK Genbezeichnung: C13orf19 oder FAM48A 3. P38IP-mRNA-Expression ist androgen- unabhängig

19 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

20 Etoposid: Glykosidderivat des Podophyllotoxins (amerikan. Maiapfel) Docetaxel: Taxoid (europ. Eibe – Taxus baccata) Chemotherapeutika

21 R1881 (Methyltrienolon)Bicalutamid Dihydrotestosteron Androgenabhängigkeit

22 LOH-PCR

23 Epitheliale Expression In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP-mRNA (Schmidt et al. 2001)

24 Konzentrationsabhängigkeit


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