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Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und.

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Präsentation zum Thema: "Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und."—  Präsentation transkript:

1 Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Untersuchungen zur Multitarget- Geninhibierung durch Nukleinsäurekonstrukte an humanen Harnblasenkarzinomzelllinien Yvonne Burmeister Dresden, in Kooperation mit

2 Einleitung:BCa, Targets: hTERT, SVV, VEGF siRNA & AS-ODN Ziel- und Aufgabenstellung Ergebnisse Zusammenfassende Bewertung und Ausblick - Überblick - 2

3 Vierthäufigster Tumor bei Männern Siebthäufigste Krebstodesursache in Deutschland Männer sind ca. 3 häufiger betroffen als Frauen Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland Gehäuftes Auftreten im Alter (Durchschnittsalter zum Diagnosezeitpunkt: 65 J.) - Das Harnblasenkarzinom - 3Einleitung

4 - Therapie des Harnblasenkarzinom (BCa) - 4 Oberflächliches BCa Transurethrale Resektion des Rezidivhäufigkeit (50-70%) Blasentumors (TURB) Progressionsrisiko (10-20%) Muskelinvasives BCa Zystektomie (Blasenentfernung) geringe Überlebensrate Zusätzlich: Chemo-, Strahlen-, Immuntherapie, Kombinationsbehandlungen Suche nach alternativen oder/und additiven Therapieformen 1carcinoma in situ 2/3papilläres Karzinom 4Infiltration in die oberflächliche Muskulatur 5Befall der tiefen Muskulatur 6/7/8Ausdehnung durch die Blasenwand Einleitung

5 - Tumor- und BCa-relevante Targets - HumaneVerlängerung- in > 90% aller Tumore, Telomerase Reverseund einschließlich des BCas, kann eine TranskriptaseStabilisierung Telomeraseaktivität nachgewiesen (hTERT)der Telomere werden SurvivinApoptose-- vierthäufigstes Transkript in (SVV)inhibitor malignen Tumoren - Korrelation mit Tumorgrad, Rezidivierung und Überleben Vaskulärer Angiogenese-- VEGF-Überexpression in endothelialerfaktor zahlreichen Tumoren Wachstumsfaktor - Korrelation mit Tumorprogression (VEGF) 5Einleitung

6 - Techniken der Geninhibierung - Antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODN) small interfering RNA (siRNA) Einleitung6

7 1. AS-ODN-Kombinationstherapie in vitro hTERT +SVV + VEGF 2. Entwicklung einer siRNA gegen VEGF 3. siRNA-Kombinationstherapie in vitro hTERT +SVV + ? 4. siRNA gegen VEGF + Chemotherapeutika - Aufgaben- & Zielstellung - Erhöhung der Wirkung der Behandlung mit Einzelkonstrukten? Steigerung der Effektivität herkömmlicher Chemotherapeutika? 7

8 - Behandlungs- und Bewertungsschema für die Kombinationen - SVV + VEGF VEGF + NS-K Nonsense-Konstrukt (NS-K) unbehandelte Zellen 8 hTERT + VEGF SVV + NS-K hTERT + SVV hTERT + NS-K hTERTSVVVEGF

9 24 h post Trf 48 h post Trf 72 h post Trf - Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF - WST-1-Viabilitätstest kombinationsbehandelter EJ28-Zellen keine Verstärkung der Wirkeffekte 9Ergebnisse

10 Apoptoseraten Zellzahl Langzeitproliferation Zellzyklusverteilung EJ28 - Kombination der AS-ODN gegen hTERT, SVV und VEGF - BehandlungGesamtapoptose ASt ,0 % ASsvv286 21,3 % ASvegf857 30,9 % NS-K1 12,1 % ASt NS-K1 30,1 % ASsvv286 + NS-K1 24,0 % Asvegf + NS-K1 24,8 % ASt ASsvv286 29,3 % ASt ASvegf857 27,4 % ASsvv286 + ASvegf857 24,1 % unbehandelte Zellen 7,1 % keine zunehmenden antiproliferativen Effekte in keiner der beiden Zelllinien bei keiner Methodik zweite Zelllinie (5637) 10Ergebnisse

11 nachgewiesene Wirksamkeit bis zu 72h bereits bei 200nM Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit siVEGF203 Takei et al., 2004 siVEGF437 Filleur et al., 2003 siVEGF865 Systematische Charakterisierung in drei BCa-Zelllinien ZelllinieEJ285637RT112 VEGF-mRNA-65 %-75 %-70 % VEGF-Protein-50 %-70 % keinen Einfluss auf das Zellwachstum (Viabilität, Langzeitproliferation, Apoptose, Zellzyklusverteilung) - Testung und Charakterisierung einer siRNA gegen VEGF - effektive, reproduzierbare Inhibierung von VEGF jedoch keine wachstumsinhibitorischen Effekte 11Ergebnisse

12 - Kombination der siRNA gegen hTERT, SVV und VEGF - WST-1-Viabilitätstest EJ28-Zellen 5637-Zellen 12 RT112-Zellen - keine Verstärkungseffekte verstärkende Effekte abhängig von der Zelllinie Ergebnisse

13 - Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika - + MMC-1 + MMC-2 + CDDP-1 + CDDP-2 + GEM-1 + GEM-2 Chemosensitivierung von BCa-Zellen WST-1-Viabilitätstest von 5637-Zellen 13Ergebnisse

14 ZellliniesiRNAMMC-1MMC-2CDDP-1CDDP-2GEM-1GEM-2 EJ28 siVEGF siVEGF siVEGF siVEGF siVEGF siVEGF RT112 siVEGF siVEGF siVEGF Kombination von siVEGF mit Chemotherapeutika - 14 Chemosensitivierende Wirkung aller Konstrukte abhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum Signifikante Unterschiede der Zellviabilität [p<0,05 (+), p<0,01 (++), p<0,001 (+++)] Ergebnisse

15 1. AS-ODN-Kombinationstherapie hTERT / SVV / VEGF 2. siRNA gegen VEGF 3. siRNA-Kombinationstherapie hTERT / SVV / VEGF 4. siVEGF + Chemotherapeutika 15 - Zusammenfassende Bewertung - keine Verstärkung der Wirkeffekte reproduzierbare Inhibierung von VEGF ohne wachstumsinhibitorische Effekte Verstärkungseffekte abhängig von der Zelllinie Chemosensitivierende Wirkung der Konstrukte abhängig von Zelllinie und Chemotherapeutikum

16 1. AS-ODN- Kombinationstherapie 2. siRNA gegen VEGF 3. siRNA- Kombinationstherapie 4. Kombination von siVEGF und Chemotherapeutika 16 - Dreierkombination in vitro - in vivo-Studien - ausführliche in vitro-Charakterisierung - in vivo-Studien - Dreierkombination in vitro - in vivo-Studien - Ausblick - Harnblase orthotopsubkutan Xenotransplantatmodell

17 Vielen Dank an die Mitarbeiter des Urologischen Forschungslabors und alle weiteren Personen, die mich bei der Anfertigung der Diplomarbeit unterstützten!

18 Mitomycin CCisplatinGemcitabin - Chemotherapeutika -

19 - Methoden - S-Phase 37,06 % G0/G1-Phase 59,75 % G0/G1-Phase 47,48 % G2/M-Phase 15,46 % G2/M-Phase % S-Phase 27,89 % Sub-G0- Peak NS-K1-behandelte 5637-Zellen ASt2331+ASvegf857- behandelte 5637-Zellen

20 AB CD - Methoden -

21

22 TargetVergleich der mRNA-ExpressionReferenzen SVV-mRNAEJ28 (++++) > 5637 (+++) > RT112 (++)Fuessel et al., 2004 VEGF-mRNAEJ28 (++++) > 5637 (++) > RT112 (++)Krause et al., 2005 hTERT-mRNAEJ28 (++++) > 5637 (+) > RT112 (+)Kraemer, pers. Mitteilung EJ mRNA-ExpressionhTERTSVVVEGFhTERTSVVVEGF ASt2331+ASsvv ASt2331+ASvegf ASsvv286+ASvegf857---


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