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MRNA-Expressionsprofilierung und Normalisierung: QPCR-Erfahrungen und Ergebnisse einer retrospektiven Studie an 106 primären Prostatakarzinom-Gewebepaaren.

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1 mRNA-Expressionsprofilierung und Normalisierung: QPCR-Erfahrungen und Ergebnisse einer retrospektiven Studie an 106 primären Prostatakarzinom-Gewebepaaren Meye A 1, Schmidt U 1, Füssel S 1, Koch R 2, Baretton G 3, Lohse A 1, Tomasetti S 1, Fröhner 1 M, Wirth MP 1 1 Klinik für Urologie, 2 Institut für Medizinische Informatik und Biometrie, 3 Institut für Pathologie, TU Dresden

2 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 2 / 20 Agenda Heterogenität des PCa Überblick zu neuen molekularen Marker Design einer SOP-QPCR-Studie erste Resultate zu 9 PCa-assoziierten Genen Arbeitshypothese: Vorhersagbarkeit organbegrenzter PCa anhand von gemeinsam überexprimierten mRNA-Markern Transferierbarkeit der Studien auf Biopsien

3 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 3 / 20 Relatives Überleben (5/10 Jahre) Nach Diagnosezeitraum PCa-Mortalität in den USA (Land mit hohem PSA-Screeninganteil) ÜLZ in Abhängigkeit vom Stadium

4 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 4 / 20 Prognostizierte Verbesserung des Überlebens im Falle einer Früherkennung (SEER-Daten ) KarzinomLokalisierte Tumoren bei Detektion (%) 5-JÜR (%) 5-JÜR, wenn alle Fälle bei Detektion lokalisierte Tumoren wären (%) Kolon-Ca Lungen-Ca Brust-Ca PCa Suche nach neuen, besseren bzw. PSA-ergänzenden Markern zum PCa-Screening

5 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 5 / 20 Marker-basiertes PCa-Progressionsmodell [Gonzalgo & Isaacs 2003] EZH2 (ÜE) >100 Genkandidaten für das PCa postuliert (<30 unabhängig validiert)

6 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 6 / 20 Arbeitsaufgaben QPCR-Studien vergleichende retrospektive Analyse bekannter und neuer Transkriptmarker (n=9; all mit ÜE, ohne Mikrodissektion!) an repräsentativen PCa-Patientenkollektiv Übertragbarkeit der Resultate auf andere, minimalisierte Untersuchungsmaterialien

7 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 7 / 20 Patienten & Gewebeproben Gewebepaare von 106 RPEs (Tu >60%, Tf <10%) Charakteristika der PCa-Patienten (alle cM0): medianes OP-Alter 64 J (48-78 J.) 59 (56%) pT2, 47 (44%) pT3/pT4 92 (87%) pN0, 14 (13% pN1) 28 (26%) GS<7, 51 (48%) GS7, 27 (25%) GS 8 alle ohne hormonelle Vorbehandlung mediane Serum-PSA (prä-OP) 8.3 ng/mL 29 (27%) adjuvant therapiert (= treatment failure) Follow-up der anderen 77 (23%) 32 Mon. (2-84) 10 mit PSA-Rezidiv (>0,2 ng/ml ) 67 ohne PSA-Rez. (im Median nach 35, Mon.)

8 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 8 / 20 QPCR-Logistik (Ablaufplan) Gefrierschnitte (10µm) in Lysepuffer Spin Tissue RNA Mini Kit (Invitek, Berlin) 2X RT parallel (je 0,5 µg; Superscript II, Invitrogen) cDNA poolen & LC-PCR mit 1:5 Verdünnung (20µl Aliquots, bei 4°C, nicht wegfrieren!) in 14/106 Fällen RNA-Mengen <1µg Bezug aller Expressions-Rohdaten auf RNA-Menge alle 13 Assays mit spez. Detektion (HP, TaqMan probes) unabh. Doppelbestimmung (bei >30% Abw. 3. Messung) Qualitätskriterien: DNA-Standards (10E1-10E7), +/- Kontr.

9 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 9 / 20 PCR-Bearbeitungsstrategie 11 Gewebepaare pro LC-Lauf gemeinsam extrahierte und umgeschriebene Probenrunden Sammlung von kompletten Wiederholungs- läufen (divergierende Doppelmessung) ohne Wiederholungen 336 PCRs/Gen keine Normalverteilung der relativen Expressionswerte Logarithmierung der Daten

10 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 10 / 20 Statistische Verfahren receiver-operating characteristic (ROC) Kurven area under curve (AUC) als Maß für die Rate korrekter Diagnosen Analyse & diagnostische Aussagekraft der Einzelvariablen (individuelle Transkripte) diagnostische Regel nach Multivariatanalyse (via AUC)

11 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 11 / 20 Resultat 1: QPCR-Standardisierung Anstieg Standardkalibrierung (GAPDH) (TBP) Korrelationskoeffizient >0,999 % ( 23 PCR-Läufe/Gen) mediane Standardabweichungen 8-14 %

12 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 12 / 20 alle QPCR-Assays hoch reproduzierbar

13 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 13 / 20 p=0.038p=0.036p= p=0.531 GAPDH HPRT PBGD TBP Tf Tu Tf Tu Tf Tu Tf Tu Verwendung von TBP für relative Normierung der Expressionsdaten (& RNA-Mengen) Resultat 2: Referenzgen-Auswahl

14 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 14 / 20 Resultat 3A: relative Expressionswerte Tu & Tf EZH2 mit geringstem & PSA mit höchstem Niveau (zmol Gen/ zmol TBP) variable Genexpression (2-5 Log-Stufen/Gen) relativ geringe mRNA-Levels in allen PCa-Zellinien

15 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 15 / 20 Resultat 3B: log relative Expression Tu & Tf

16 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 16 / 20 Höchste Überexpressionen für: DD3 (>40-fach im Median) & TrpM8 (>4-fach im Median) Resultat 4: Tu:Tf Ratios

17 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 17 / 20 p=0.002 p=0.003 p=0.009 Resultat 5A: Subgruppenanalyse OC vs. NOC (vs. Tf) Verwendbarkeit einzelner Marker zur Vorhersage organbegrenzter PCa???

18 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 18 / 20 Resultat 5B: Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf) p=0.102 p=0.099

19 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 19 / 20 Resultat 5C: Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf) p=0.150 p=0.113

20 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 20 / 20

21 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 21 / 20 Diagnostische Regel eines Logit-Modells zur PCa-Vorhersage Beispielrechnung für Patient 1: p=Wahrscheinlichkeit für ein PCa leitet sich aus folgender Transformation ab: p = exp(logit)/[1+exp(logit)] = exp(2.298)/[1+exp(2.298)] = = 99,9% Tf-Expression: Prostein/TBP=2,01, EZH2/TBP=1,17, TRPM8/TBP=1,86, DD3/PCA3/TBP=0,396 p für Tu =6,9%, d.h. 93,1% (=100%-6,9%) Wahrscheinlichkeit eines TF

22 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 22 / 20 Einzelmarker (DD3) vs. Kombination

23 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 23 / 20 Weitere Schritte Gewebepaare Erweiterung des Patientenkollektivs auf 150 Patienten (cDNA-Bank!) Messung von weiteren PCa-assoziierten Markern, ggf. Integration in das Modell Definition eines relevanten Panels (max. 5 Marker) Vgl. der mRNA-Expressionsmuster mit CGH-Profilen zu definierender Subgruppen (Kooperation Homburg) prospektive Reevaluierung geeigneter Marker (Biopsiestudie)

24 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 24 / 20 Reevaluierung an Biopsiematerial Simulation diagnostischer Stanzen am RPE-Präparat Gefrierkonservierung der Biopsien Schnitte systematisch für H&E und RNA-Extraktion Verwendung der Biopsien für QPCR bei primärer Nachweisbarkeit von >50 Molekülen TBP absolut Markerpanel: PSA, Trp-M8, Prostein, EZH2, DD3 cDNA-Menge aus 1/8 bis 1/16 Biopsieteil ausreichend

25 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 25 / 20 QPCR an Biopsien

26 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 26 / 20 6-Markerbestimmung aus Gesamtbiopsien

27 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 27 / 20 Hypothetisches Modell für differentiell exprimierte PCa-Transkriptmarker

28 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 28 / 20 Vision - additives molekulares Staging Anwendungsgebiete PCa: Stanzbiopsie, LN-Gewebe Serum-/Blut-, Urinprobe Disseminierte Tumorzellen, Mikrometastasen Identifizierung von Patienten mit niedrigem Progressionsrisiko (watchful waiting) Target-spezifische(re) Therapieoptionen (auf Grundlage einer molekularen Charakterisierung des Individualtumors) 15-20mm, 0,8 mm Routinepathologie & & molekulare Diagnostik

29 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 29 / 20 Kenntnisstand molekulargenetische PCa-Marker tumorbiologische Heterogenität basiert auch auf einer extremen genetischen Diversität dieser Ca-Entität (kein PCa-Gen) hoffnungsvolle Marker (Prostata- oder/und PCa-spezifisch) mit diagn. & progn. Potential identifiziert (post-PSA-Zeit) einige gleichzeitig mögliche Therapietargets (z.B. Immuntherapie) Testung molekular-basierter, modifizierbarer Therapiestrategien extensive Evaluierung der klinischen Test-Wertigkeiten notwendig klinische Anwendung additiver molekularer Markermuster für frühzeitige Diagnosemöglichkeit (Screening-Marker) individuellere Prognoseabschätzung & Therapieentscheidung Abschätzung eines patientenspezifischen Therapieansprechens

30 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 30 / 20 Marker 1: DD3 PCA3 (uPM3 TM )-Transkript differential display code 3, 9p21-22 [Bussemaker et al. 1999] Gen mit der bisher höchsten bekannten PCa-Spezifität (RT-PCR) identifiziert als fach überexprimiert (Northern) in 53/56 PCa- Geweben (0/56 korrespondierenden Tf-Prostategeweben) nichtkodierende mRNA der Prostata-Epithelzellen im Median 66-fache ÜE (QPCR, Detektierbarkeit bei <10% Tu-Anteil) DD3 PCA3 im Urin (20-30mL) nach rektaler Palpation nachweisbar relative mRNA-Expression von DD3 PCA3 & PSA via QPCR kurzfristige Kommerzialisierung (DiagnoCure, Quebec) für 80 Mio. US$ Patent, >40 Mitarbeiter an Assay-Entwicklung & Validierung Übernahme durch 2 Diagnostikfirmen (Genprobe, Bostwick Laboratories)

31 Meye et al, Klinik für Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106 primären PCa-Gewebepaaren Folie 31 / 20 Marker 5: EZH2 (ÜE im HRPC) polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2 transkriptioneller Repressor (zelluläre Identität) spezifisch in HRPC überexprimiert (mRNA & Protein) insbesondere in metastatische PCa erhöhte Expression PCa mit einer EZH2-ÜE ~ direkt mit geringer ÜLZ (nicht mit GS oder Tumorstadium) unabhängige prognostische Relevanz ÜE-Detektion im Gewebe = negativer Prognoseprädiktor experimentelle EZH2-Blockade (siRNA) in PCa-Zellinien: Viabilitäts- & Wachstum (aber keine Apoptose)


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