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Title Forschungszentrum Jülich Institut für Chemie und Dynamik der Geosphäre IV: Agrosphäre TP 2.3: Umsatz von Maisstroh in Mikrokosmen nach Behandlung.

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2 Title Forschungszentrum Jülich Institut für Chemie und Dynamik der Geosphäre IV: Agrosphäre TP 2.3: Umsatz von Maisstroh in Mikrokosmen nach Behandlung mit Benazolin und Benzoapyren - Komplexe mikrobielle Gemeinschaften und Isolierung prozessrelevanter Mikroorganismen Beate Bulawa, Jost Liebich

3 Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost LiebichICG IV: Agrosphäre Aufgaben PA2 FZ Jülich

4 Mikroorganismen: komplexe Gemeinschaft bzw. definierte Gemeinschaft Boden: nativ (Typische Parabraunerde) bzw. geglüht (frei von organischem C) Ernterückstände: natives Maisstroh 14 C-Maisstroh Xenobiotika: Benazolin Benzo[a]pyren Besonderheiten der Mikrokosmen Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost LiebichICG IV: Agrosphäre Natronkalk – Falle zur Fixierung von 14 CO 2 Boden

5 Aufgabe 1: Kurzfristiger Umsatz von Maisstroh durch komplexe mikrobielle Gemeinschaften Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost LiebichICG IV: Agrosphäre Werden die Struktur und die Funktion der mikrobiellen Gemeinschaften während des Maisstrohumsatzes durch die Xenobiotika Benazolin und Benzoapyren in verschiedenen Konzentrationen beeinflusst? Fragestellung: 1. Ansatz: 6-Wochen-Versuch mit Benazolin (0, 1, 10 und 50 ppm)in geglühtem und nativem Boden Bestimmung von: Mikrobieller Aktivität (DMSO-Reduktase-Raten) Mineralisierung von 14 C-markiertem Maisstroh Boden-pH

6 Ergebnisse Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost LiebichICG IV: Agrosphäre Über den Versuchszeitraum war keine Hemmung der mikrobiellen Aktivität durch Benazolin zu erkennen. Die Mineralisierung von 14 C-Maisstroh wurde nur zu Beginn und bei Einsatz von 50 ppm Benazolin gehemmt.

7 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Vorversuch Ziel: Einfluss von Benazolin- Herbizides auf die mikrobielle Aktivität im Boden Analytik: - Abbaustudien in Boden-Mikrokosmen - DMSO-Raduktase-Rate - pH-Wert-Messung 1. Geglühter Boden (steril) / Frischboden (jew. 250 g) 2.Maisstroh (tw. 14 C-markiert; 1 g / 100 g Boden) 3.Komplexe mikrobielle Gemeinschaft in Form einer Bodensuspension (1 ml /100 g Boden) 4. Benazolin Einsatz: 1 mg kg -1, 10 mg kg -1 und 50 mg kg -1 zusätzlich Kontrolle ohne Benazolin 5.~ 40 % Wk max 6. Inkubationszeit: 6 Wochen Komponenten des Versuches:

8 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Die Messung erfolgte mittels eines Gaschromatographs nach 3 Std.-iger Inkubation bei 40°C mit einer 10%-igen DMSO- Lösung (w/v) Die Methode beruht auf der folgenden 2-Elektronen-Transfer-Reaktion: (CH 3 ) 2 SO + 2H + (CH 3 ) 2 S + H 2 O DMSODMS

9 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Glasrohr Quarzwolle Natronkalk Quarzwolle Natronkalk Quarzwolle Erlenmeyerkolben geglühter Boden/ Frischboden

10 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Versuch-Teil I: KONTROLLE mit der Maisstroh-Zugabe aber ohne Xenobiotika - Bodenfeuchte 40 % Wk max, - Inkubationszeit 90 Tage, Komponenten des Versuches: Geglühter Boden + Maisstroh (teilweise 14 C- markiert) + komplexe mikrobielle Gemeinschaft (Bodensuspension) Nativer + Maisstroh Benazolin 50 ppmBenzo[a]pyren 1 ppm Benazolin 200 ppmBenzo[a]pyren 50 ppm Benzo[a]pyren 200 ppm KONTROLLE ohne Maisstroh Ziel/Fragestellung: Wird das Verhalten der mikrobiellen Gemeinschaften im Boden, die am Umsatz von pflanzlicher abgestorbener Biomasse beteiligt sind, durch die ausgewählten Xenobiotika beeinflusst?

11 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Vorgesehene Analyse: Mineralisierung von 14 C-markiertem Maisstroh, DMSO-Reduktase-Rate, Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft mittels DGGE Quantitative Biomasse Bestimmung (DNA-Gehalt und/oder Fluoreszenz-Mikroskopie) Pilzliche Biomasse (Ergosterol- Gehalt) pH-Messung, Bildung von Huminstoffen: Gelpermeationschromatographie (GPC), flüssige NMR

12 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Die Messung erfolgte mittels eines Gaschromatographs nach 3 Std.-iger Inkubation bei 40°C mit einer 10%-igen DMSO-Lösung (w/v) Die Methode beruht auf der folgenden 2-Elektronen-Transfer-Reaktion: (CH 3 ) 2 SO + 2H + (CH 3 ) 2 S + H 2 O DMSODMS

13 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Glasrohr Quarzwolle Natronkalk Quarzwolle Natronkalk Quarzwolle Erlenmeyerkolben geglühter Boden/ Frischboden

14 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Die Messung erfolgte mittels eines Gaschromatographs nach 3 Std.-iger Inkubation bei 40°C mit einer 10%-igen DMSO-Lösung (w/v) Die Methode beruht auf der folgenden 2-Elektronen-Transfer-Reaktion: (CH 3 ) 2 SO + 2H + (CH 3 ) 2 S + H 2 O DMSODMS

15 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Glasrohr Quarzwolle Natronkalk Quarzwolle Natronkalk Quarzwolle Erlenmeyerkolben geglühter Boden/ Frischboden

16 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Veränderung der mikrobiellen Diversität bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Xenobiotika Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft Extraktion von 16S rDNA Quantitative Biomasse Bestimmung Analyse von DNA DNA-Gehalt/PCR-Produkt-Bestimmung mittels Flureszenz-Spektroskopie z.B. mit PicoGreen (Molekular Probes)- einem dsDNA-Fluoreszenz-Farbstoff Amplifikation geeigneter Sequenzen durch PCR Auftrennung mit Hilfe der denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE) (Bandenmuster von PCR-Produkten)

17 Quantifizierung der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Vorteile des PicoGreen-Farbstoffes: sehr sensibler, spezifische für die dsDNA Fluoreszenz-Farbstoff, ermöglicht die Quantifizierung von DNA im Bereich zwischen 25 pg / ml und 1 µl /ml, Messung erfolgt bei 480 nm Anregung und 520 nm Emission

18 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre 30 % denat. Agens 70 % denat. Agens Laufrichtung der DGGE Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benazolin nach 14 Tagen Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. BK: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B50: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm B200: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm BKB200 B50 Keine Bande = X X X X X

19 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre 30 % denat. Agens 70 % denat. Agens Laufrichtung der DGGE Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 49 Tagen Inkubation. BK: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B50: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm B200: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie B50 B200BK 2 31 Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benazolin nach 49 Tagen

20 Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benazolin nach 14 und 49 Tagen Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. BK1: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B50/1: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm B200/1: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm Bandenmuster nach 49 Tagen: A: Kontrolle (geglühter Boden ohne Benazolin) B: Boden mit Benazolin Konzentration 50 ppm C: Boden mit Benazolin Konzentration 200 ppm 30 % denat. Agens 70 % denat. Agens Laufrichtung der DGGE BK1 B50/1 B200/1 ABC

21 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre 30 % denat. Agens 70 % denat. Agens Laufrichtung der DGGE Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benzo-a-pyren nach 14 Tagen Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. BapK: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) Bap1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 1 ppm Bap50: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm Bap200: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm BKB200 B50 Keine (X) X X X schwach X BapKBap1Bap50Bap200

22 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre 30 % denat. Agens 70 % denat. Agens Laufrichtung der DGGE Quantifizieren der extrahierten DNA mittels Fluoreszenz-Spektroskopie Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benzo-a-pyren nach 49 Tagen Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 49 Tagen Inkubation. BapK: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) Bap1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 1 ppm Bap50: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm Bap200: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm Keine (X) X X X schwach X 2 1 BapKBap1Bap200Bap50

23 Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre 30 % denat. Agens 70 % denat. Agens Laufrichtung der DGGE Veränderung der DGGE-Bandenmuster bei der Humifizierung von Ernterückständen unter dem Einfluss von Benzo-a-pyren nach 14 und 49 Tagen Bandenmuster der eingesetzten mikrobiellen Gemeinschaft im geglühten Boden nach 14 Tagen Inkubation. A: BapK: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) B: Bap1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 1 ppm C: Bap50: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm D: Bap200: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm Bandenmuster nach 49 Tagen: A1: Kontrolle (ohne Benzo-a-pyren) B1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 1 ppm C1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm D1: Boden mit Benzo-a-pyren Konzentration 50 ppm ADCBA1D1C1B1

24 Charakterisierung der pilzlichen Dynamik bei der Humifizierung von Ernterückständen Forschungszentrum Jülich ICG IV: Agrosphäre Molekularbiologische Analyse: Extraktion von 18S rDNA Pilzliche Biomasse: Ergosterol- Extraktion Bandenmuster von partiell amplifizierter 18S rDNA nach Auftrennung mittels denaturierender Gradienten Gelelektrophorese die Extraktion erfolgt mit Hexan, Quantifizierung über Eichstandards mittels Hochleistungs- Flüssigchromatographie (HPLC)

25 Aufgabe 2: Definierte Gemeinschaften Kultivierung Isolierung Charakterisierung anhand physiologischer Profile und 16S bzw. 18S rDNA-Sequenzdaten Boden- Mikrokosmen mit definierten Gemeinschaften nativen Gemeinschaften Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost Liebich, ICG IV: Agrosphäre Bodenprobe Bodenisolate

26 Fragestellung: Identifizierung von Mikroorganismen, die am Umsatz von Maisstroh beteiligt sind und in den Modell-Mikrokosmen mit definierten Gemeinschaften eingesetzt werden können (Aufgabe 3) Methodik: Extraktion von DNA aus allen Isolaten Charakterisierung des DGGE-Laufverhaltens der amplifizierten DNA Identifizierung von Doppelisolaten (z.B. mit ERIC- oder BOX-Fingerprint) Vergleich der DGGE-Bandenmuster ausgewählter Bodenproben mit dem DGGE-Laufverhalten der amplifizierten Isolate-DNA Bestätigung gleicher Identitäten durch Sequenzierung einzelner Banden Mikrobiologische Charakterisierung Analytik von Laccase- und Protease-Bildung der Isolate Aufgabe 2: Definierte Gemeinschaften Forschungszentrum Jülich Beate Bulawa, Jost Liebich, ICG IV: Agrosphäre

27 Zeitplan Forschungszentrum Jülich Jost Liebich, Beate Bulawa ICG IV: Agrosphäre

28 Planungen Forschungszentrum Jülich Jost Liebich, Beate Bulawa ICG IV: Agrosphäre Charakterisierung der Bodenisolate Mikrokosmos-Versuche in geglühtem und nativem Boden mit Benazolin und Benzo[a]pyren in verschiedenen Konzentrationen mit begleitender Analytik der mikrobiellen Gemeinschaften. Einsatz definierter Gemeinschaften in den Abbauversuchen. Untersuchung der Humifizierungsprozesse in Bodensäulen

29 Zeitplan (Antrag) Forschungszentrum Jülich Jost Liebich, Beate Bulawa ICG IV: Agrosphäre 1.Jahr: Kurzfristiger Umsatz von Maisstroh in Mikrokosmen mit definierten und komplexen Gemeinschaften in geglühtem Boden Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik 2.Jahr:Mikrokosmen mit definierten Gemeinschaften in nativem Boden und/oder Einsatz verschiedener Ernterückstände Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik 3.Jahr: Bodensäulenversuche zur Validierung des Modellsystems Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik Einsatz der Xenobiotika Benazolin und/oder Benzoapyren

30 Zeitplan (Juli 2001) Forschungszentrum Jülich Jost Liebich, Beate Bulawa ICG IV: Agrosphäre 1.Jahr: Kurzfristiger Umsatz von Maisstroh in Mikrokosmen nur mit komplexen mikrobiellen Gemeinschaften in geglühtem und nativem Boden Einsatz der Xenobiotika Benazolin und/oder Benzoapyren Charakterisierung prozessrelevanter Bodenisolate 2.Jahr:Mikrokosmen mit definierten Gemeinschaften in nativem Boden (Umsatz von Maisstroh) 3.Jahr: Validierung der Mikrokosmen Untersuchung der mikrobiellen und physikochemischen Dynamik Einsatz der Xenobiotika Benazolin und/oder Benzoapyren


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