4. Kultivierung von MO pH-Wert pH 7 = 10-7 mol/l H+

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1 4. Kultivierung von MO pH-Wert pH 7 = 10-7 mol/l H+
bei pH 5 die [H+] verdoppeln: log (2*10-5) = pH 4,7 pH Meter: pH Elektrode elektrochemische Potentialmessung hohe Genauigkeit

2 4. Kultivierung von MO pH-Wert pH 7 = 10-7 mol/l H+
Indikatorfarbstoffe rel. ungenau auf Stäbchen aufgebracht – Mischung verschiedener Farbstoffe

3 4. Kultivierung von MO pH-Wert Puffer:
wässrige Lsgen von Substanzen oder Substanzgemischen, die Wasserstoff bzw. Hydroxidionen abfangen oder nachliefern können, wodurch der pH-Wert in bestimmen Grenzen gehalten werden kann nach Puffertabellen (zB.: Geigy oder Küster, Thiel: Rechentafeln für die Chemische Analytik, De Gruyter) werden Puffergemische hergestellt (2 bis 4 verschiedene Lsgen) für verschiedene pH Werte unterschiedliche Pufferlösungen für Nährböden oft anorganische Phosphate org. Pufferbestandteile können von MO abgebaut werden (bspw. Citrat oder Acetat)

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6 aus: Geigy: Wissenschaftliche Tabellen

7 4. Kultivierung von MO Gefäße – Laborglasware Schottflaschen:
Nährmedienherstellung mit Dispenser Aufbewahrung (Schraubverschluss) NICHT geeicht Erlenmeyerkolben Nährmedienherstellung Kulturgefäß: erleichtert Gasaustausch (aerob) „Allzweckglas“

8 4. Kultivierung von MO Gefäße – Laborglasware Schottflaschen:
Nährmedienherstellung mit Dispenser Aufbewahrung (Schraubverschluss) NICHT geeicht Erlenmeyerkolben Nährmedienherstellung Kulturgefäß: erleichtert Gasaustausch (aerob) „Allzweckglas“

9 4. Kultivierung von MO Gefäße – Laborglasware Messzylinder Messkolben
auf „ex“ geeicht Zugabe eines bestimmten Volumens Messkolben auf „in“ geeicht zur Herstellung definierter Lösungen (z.B. „molare Lsgen“ (1 M KH2PO4)) einwiegen und bis zur Marke auffüllen

10 4. Kultivierung von MO Gefäße – Laborglasware Pipetten:
Glaspipetten (Skalierung), Messpipetten Vollpipetten (ähnlich Messkolben mit einer Marke) Kolbenhubpipetten mit Plastikspitzen

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12 4. Kultivierung von MO Gefäße – Laborglasware Glasqualität:
verschiedene Sorten/Qualitäten Borosilicatglas am besten geeignet Markennamen: Pyrex, Duran, Solidex hohe chemische Beständigkeit sehr hitzebeständig (bis zu 200 °C bei dickwandigen Gefäßen) Quarzglas: Photometrie: UV-Durchlässigkeit bis 180 nm

13 4. Kultivierung von MO Gefäße – Kulturgefäße

14 4. Kultivierung von MO Herstellung von Agarplatten
Einwiegen der NM Bestandteile Zugabe von Wasser (ev. zum vollständigen Lösen erwärmen bzw. aufkochen) Zugabe von Agar Nährboden (Nährmedium mit Agar) wird autoklaviert (ev. im Wasserbad/Wärmeschrank bei ca. 50°C warmhalten) NB wird unter aseptischen Bedingungen in sterile Petrischalen gefüllt („gegossen“) - LF Agarplatte = eine Petrischale mit ca. 20 ml Nährboden Platten abkühlen lassen damit der Agar fest wird Petrischalen beschriften (Unterseite) zur weiteren Bearbeitung fertig Aufbewahrung im Kühlschrank (4 °C Raum)

15 4. Kultivierung von MO Herstellung von Schrägagarröhrchen
Einwiegen der NM Bestandteile Zugabe von Wasser (ev. zum vollständigen Lösen erwärmen bzw. aufkochen) Zugabe von Agar Nährboden (Nährmedium mit Agar) wird autoklaviert (ev. im Wasserbad/Wärmeschrank bei ca. 50°C warmhalten) NB wird unter aseptischen Bedingungen in sterile Röhrchen gefüllt: ca. 5 bis 10 ml je Röhrchen auf Ablage schräg ablegen (z. B. auf Pipette o.Ä.) abkühlen lassen beschriften zur weiteren Bearbeitung fertig Aufbewahrung im Kühlschrank (4 °C Raum)

16 4. Kultivierung von MO Abfüllen von NL
Herstellung des gewünschten Vol. an NL Abfüllen in entsprechende Kulturgefäße (z.B. Erlenmeyerkolben, Eprouvetten) Kolben mit Wattestopfen verschließen, Eprouvetten mit Überwurfkappe Watte mit Alufolie abdecken autoklavieren abkühlen lassen (ev. im kalten Wasserbad) Lagerung auf 4°C (bei Platzmangel wird das gesamte Vol autoklaviert, gelagert und erst bei Bedarf in separat sterilisierte Gefäße abgefüllt)

17 4. Kultivierung von MO Impftechniken
„beimpfen“ = Übertragung einer gewissen Menge an lebens- und vermehrungsfähigen Materials (MO) in ein geeignetes Medium „Inokulum“ = vermehrungsfähige Mikroorganismen, susp. als Inokulum kommen Reinkulturen auf Agarplatte oder NL, aber auch Mischkulturen (meist in NL) in Frage Größe des Inokulums kann variiert werden (Fragestellung) für Reinkulturgewinnung: wenig Inokulum auf Impföse auf eine Agarplatte überimpfen Anreicherung von MO: z.B. over-night Kultur als Versuchsvorkultur Zugabe einer definierten Menge mit definierter Zell- oder Keimzahl (z.B. aus Vorkultur)

18 4. Kultivierung von MO Impftechniken Grundregeln:
Arbeiten unter dem Laminar-Flow (aseptische Bedingungen, Personenschutz) Kulturgefäße (inkl. Inhalt) müssen steril sein Arbeitsgerät muß steril sein (Impföse, Spartel,…) Kulturgefäße werden vor dem Überimpfen mit Inhalt (NL), Kulturname und eigenem Namen versehen (wasserfester Stift !!!) nach Lagerung im Kühlschrank sollte NL angewärmt werden (je nach Org.) niemals in Gefäße greifen, immer am unteren Rand anfassen beim Überimpfen ruhig und sicher arbeiten

19 4. Kultivierung von MO Impftechniken Arbeitsgeräte

20 4. Kultivierung von MO Impftechniken Arbeitsgeräte

21 4. Kultivierung von MO Impftechniken Ausglühen der Impföse/ -nadel

22 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation statische (batch) Kultur
wird einmal angesetzt und stellt damit ein geschlossenes System dar z.B.: in einen EK mit 100 ml NL wird E. coli überimpft und 10 Tage inkubiert relativ einfach und im normalen Laboralltag weit verbreitet z.B. für Vorkulturen kontinuierliche Kultur im Chemostaten nach Maßgabe wird Medium nachgefüttert, der pH Wert korrigiert o.Ä. kein geschlossenes System oftmals aufwändig, relativ lange Vorbereitungszeiten im Normalfall aber recht gut reproduzierbar

23 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Temperatur jeder MO hat eine optimale Wachstumstemp. (jene Temp. mit der maximalen Wachstumsrate) (z.B. E. coli 37 °C, B. stearothermophilus 55 °C, B. psychrophilus 18 °C) ABER: Wachstumsbereich (z.B. E. coli zw. 30 und 37 °C) van‘t Hoffsche Regel: eine Erhöhung der Temp. um 10°C (unterhalb des Optimums!!!!) bewirkt eine (ca.) Verdopplung der Wachstumsrate bei den meisten Bakterien (Anhalt) Bebrütungstemp. hat nicht nur Auswirkung auf Wachstumsrate, sondern z.B. auch auf die chemische Zusammenseztung von Zellen (Bsp. Serratia marcescens: Einlagerung von rotem Pigment bei 30°C, weißliche Kultur bei 37°C)

24 Serratia marcescens bei 30 inkubiert

25 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Temperatur mesophil: max. Wachstumsrate bei 20 bis 42°C thermotolerant: Wachstum bis 65°C thermophil: Max. WR bei 42 bis 70°C extem thermophil/hyperthermophil: Wachstum bis zu 100°C psychrophil/kryophil: Temp. Optimum unter 20°C und Minimum bis zu -5°C

26 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Temperatur meist mesophile Organismen: °C Meschen-/Tierpathogene: bei 35 – 37 °C Bodenmikrooganismen: bei 20 bis 25 °C Pilze (inkl. Hefen): bis 25 °C Inkubation in Temperaturschränken (Heiz-/Kühlschrank), aber auch im Wasserbad

27 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation Einflussfaktor Licht
chemotrophe Org. brauchen kein Licht für ihr Wachstum (Energie kommt aus der Oxidation org/anorg. Substrate, sondern kann ev. schädigen (Photooxidation) chemotrophe Org. werden im Dunkel inkubiert Phototrophe: Licht als (Haupt-)Energiequelle Sporulation: für manche Pilze wird zur Induktion der Sporulation Licht eingesetzt

28 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff strikt aerob: atmen O2 (Elektronenakzeptor) wachsen bei O2 Konz. der Luft (21%) (z.B. Azotobacter, Pseudomonas): mikroaerophil: atmen O2, wachsen jedoch nur bei niedrigeren O2 Konz. <21% (z.B. Campylobacter) strikt anaerob: O2 kann zur Energiegewinnung nicht verwendet werden (toxisch) (z.B. Clostridium, Desulfovibrio) aerbotolerant: Wachstum mit und ohne O2, Energiegewinnung jedoch ausschließlich durch Gärung (z.B. Milchsäurebakterien) fakulativ anaerob: Wachstum mit und ohne O2, können zwischen Atmung und Gärung umschalten

29 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff Oberflächenkultur: auf Agar: ausreichende O2 Versorgung, Austrocknung Zweiphasenkultur: Agarplatte mit Flüssigkeit überschichtet Deckenkultur: Wachstum als Haut an der Oberfläche (v.a. Pilze, schleimbildende MOs) stehend inkubieren

30 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff Submerskultur: submers = „untergetaucht“ MOs werden in Flüssigkeit subspendiert (und meist geschüttelt) je größer die Phasengrenzfläche, desto mehr O2 löst sich in der Flüssigphase Schütteln: Rundschüttler (kreisförmig), Längsschüttler (hin-her), Over-head Schüttler (kreisförmig über Deckel) Rühren Art des Gefäßes (Schikanen) Einleiten von Luft

31 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff Submerskultur: Löslichkeit von O2 in wässrigen Lsgen abhängig von: Temperatur Salzkonzentration bei 30°C sind ca. 7 mg O2 gelöst (0,22 mmol) = für die Oxidation von ca. 6,5 mg Glk notwendig

32 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff

33 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff mikroaerobe Inkubation bei O2 Gehalten zw. 1 und 15 % (v/v) Kultivierung auf halbfesten NB (ca. 4 g Agar) „Stichagar“: durch die Schichtung im Agar entsteht ein Gradient in der O2 Konz. und die Org. wachsen an jenen Stellen, die für sie die richtige O2-Konz. bereitstellen Kultivierung im Anaerobiertopf mit Gasphasengeneratoren auf herkömmlichen festen Agarplatten (ca. 20 g Agar)

34 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff mikroaerobe Inkubation fakultativ anaerobe MO

35 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff mikroaerobe Inkubation fakultativ anaerobe MO

36 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff anaerobe Inkubation Produkte des molekularen Sauerstoff toxisch (z.B. H2O2) große Unterschiede in der Sauerstoffempfindlichkeit (Methanosarcina thermophilia > Clostridium tetani > Clostridium acetobutyricum) Redoxpotential (E`0 [mV]): Standard NL: ca mV hpts. durch das Redoxsystem ½ O2 + 2 e- → O2- Methanogene wachsen erst ab ca bis mV

37 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff anaerobe Inkubation Redoxpotential: durch Aufkochen einer NL wird O2 aus dem Medium getrieben Restsauerstoff: Zugabe eines reduzierenden Stoffes: L-Cystein, Na-Thioglycolat, Na-Sulfid Redoxindikatoren: Methylenblau (E`0 = +11 mV), Resazurin (E`0 = -51 mV), Phenosafranin (E`0 = -252 mV)

38 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff anaerobe Inkubation Arbeiten mit Anaerobiern: NM autoklavieren und schnell abkühlen (ohne zu schütteln) Nährböden schnell verwenden und im Anaerobiertopf inkubieren flüssige NM für strikte Anaerobier mit Widdelkolben abfüllen

39 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff anaerobe Inkubation Anaerobiertopf:

40 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff anaerobe Inkubation Widdelkolben:

41 4. Kultivierung von MO Bebrütung – Inkubation
Einflussfaktor Sauerstoff anaerobe Inkubation Arbeiten mit Anaerobiern: Wright-Burri Röhrchen

42 5. Anreicherung und Isolierung
MO kommen in der Natur fast ausschließlich als Mischpopulationen vor viele unterschiedliche MO bzw. Stämme mit einer Vielzahl an physiologischen Voraussetzungen für eine aussagekräftige Beschreibung von MO ist in der Regel eine Reinkultur notwendig sind in einem Habitat nur geringe Abundanzen des Zielorganismus‘ zu finden, so muss eine Anreicherungskultur angelegt werden, die Bedingungen schafft, welche den Org. physiologisch bevorzugen

43 5. Anreicherung und Isolierung
Anreicherungskultur: setzt Kenntnis über Zielorganismus voraus als geschlossenes System: batch-Ansatz zumeinst in synthetischem Flüssigmedium – erleichtert die Manipulation (z.B. Austausch eines Salzes oder einer C-/N-Quelle) Inokulation mit der Probe (Bodenextrakt, Schlamm etc.) Medium richtet sich nach den Rahmenbedingungen der Probe (Bodenprobe mit tiefem pH Wert – Medium mit niedrigem pH Wert etc)

44 5. Anreicherung und Isolierung
Beispiel Anreicherungskultur: Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio zu finden in Sedimenten, eutrophen Gewässern, Faulschlamm, Abwasserleitungen (!!) benötigt div. Endprodukte anaerober Abbauwege als Elektronendonatoren und C-Quellen Sulfat als Elektronenakzeptor es bildet sich H2S anaerobe Bedingungen niedriges Redoxpotential E`0 = < -100 mV

45 5. Anreicherung und Isolierung
Beispiel Anreicherungskultur: Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio Herstellen eines NB mit Salzen, Laktat, Hefeextrakt und FeSO4 zum NB eine sterilen Eisennagel (ausglühen) zugeben (senkt das Redoxpotential) z.B. in Wright-Burri Röhrchen füllen mit z.B. Sediment inokulieren einige Tage bei 30°C inkubieren Auswertung: Kulturen durch deutlich schwarz-Färbung erkennbar sitzen oft auf Eisennagel (schwarzer Belag) Mikroskop: kleine gekrümmte Stäbchen, g- Geruch nach Schwefelwasserstoff (!!!!)

46 5. Anreicherung und Isolierung
Beispiel Anreicherungskultur: Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio Wasserstoffver-brauch lässt Röhrchen (b) absinken, bzw. drückt NL in Flasche II (d)