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C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme.

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Präsentation zum Thema: "C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme."—  Präsentation transkript:

1 C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

2 Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien Von Christian Stelter

3 Überblick 1.Subtraktive Hybridisierung Ziel der Methode? Welche Vorteile? 2.Prinzipieller Ablauf der Methode 3.Praktische Ergebnisse 4.Ausblick

4 Entwicklung Subtractive Hybridization als Basis, um genetische Unterschiede zu identifizieren. Identifizierung von Genaktivität für Embryonalentwicklung Krebsentstehung Identifizieren von Unterschieden im Genom verschiedener Stämme von Bakterien komplexer eukaryotischer Lebewesen

5 Biotechnologie in menschlichen Kulturen unkontrollierte Fermentation 6000 v. Chr.Alkoholische Getränke im Zweistromland Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln

6 Notwendigkeit zur Diagnose genetische Identität Stabilität von Starterkulturen hygienische Risiken wirtschaftliche Effizienz routinemäßige Verifikation durch genetische Fingerabdrücke

7 Notwendigkeit zur Diagnose Fingerprinting

8 Notwendigkeit zur Diagnose Verständnis probiotischer Eigenschaften

9 Anwendbarkeit der SSH Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren Um darauf aufbauend a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren

10 Subtraktive Hybridisierung dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen

11 Subtraktive Hybridisierung gezielte Identifikation von Unterschieden besonders vorteilhaft

12 Subtraktive Hybridisierung

13

14 Ausgangs- material

15 Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Fragmentieren

16 Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Mischen

17 Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Denaturieren

18 Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Hybridisieren

19 Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Isolieren

20 wichtige Entwicklungsschritte Entwicklungen innerhalb der Subtraktiven Hybridisierung betrafen die Isolierung der stammspezifischen, einzelsträngigen DNA a) Immobilisierung b) Suppression Effekt

21 Isolierung durch Immobilisierung Immobilisierte Subtraktor-DNA

22 Isolierung durch Immobilisierung Zugegebene, denaturierte Proben-DNA

23 Isolierung durch Immobilisierung Homologe DNA-Fragmente werden dem Überstand entzogen

24 Suppression Subtractive Hybridization Verwendung von Adaptoren Vorteile: 1)Geringste Mengen 2)Suppression Effekt

25 Suppression Effekt

26 Vorteile der SH/SSH Geringe Materialanforderungen (PCR) bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes

27 Bisherige Anwendung Genomanalysen im medizinischen Bereich: Identifikation von Virulenzgenen neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen Antibiotikaresistenzen Oberflächenstrukturen PAIs: pathogenicity islands

28 Praktische Ergebnisse Anwendung auf Milchsäurebakterien Lactococcus St Lactococcus St Isolierung der unterschiedlichen Regionen: Funktionen der unterschiedlichen Regionen Stammspezifische PCR-Systeme Suche nach Eigenschaften in anderen MOs

29 Anreicherung stammspezifischer Fragmente 1526 – 1760 = ?1760 – 1526 = ?

30 Gefundene Unterschiede Lactococcus Stamm 1760 A2: Bacteriocin-Produktion A5: Funktion unbekannt Lactococcus Stamm 1526 A22: zellwandassoziierte Proteinase A23: Restriktionsmodifikationssystem [subunit (hsdS) gene]

31 PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme A2:Nisin A5:? A22:Proteinase A23:hsdS Nisin ? Proteinase hsdS

32 PCR-Systeme auf weitere Stämme 89 bp:? 166 bp: Proteinase 271 bp: hsdS 322 bp: Nisin

33 Weitergehende Anwendungen Identifizieren von probiotischen Eigenschaften größere Überlebensrate dauerhafte Ansiedlung Reduktion von mutagenen Enzymen Stimulation von Makrophagen Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress

34 Danke Danisco Cultor Niebüll GmbH Dr. Udo Friedrich PD Dr. Winfried Hausner

35 Noch Fragen? Wir haben einen Überschuss an einfachen Fragen und einen Mangel an einfachen Antworten. Lothar Schmidt

36 Immer noch Fragen? Gott weiß alles, sagt es aber nicht. Ich weiß nichts und sage alles. unbekannt

37 Suppression Subtractive Hybridization

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