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Veröffentlicht von:Carla Reichenberg Geändert vor über 10 Jahren
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Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
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Entwicklung stammspezifischer PCR-Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien Von Christian Stelter
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Überblick „Subtraktive Hybridisierung“ Ziel der Methode? Welche Vorteile? 2. Prinzipieller Ablauf der Methode Praktische Ergebnisse Ausblick
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Entwicklung „Subtractive Hybridization“ als Basis, um • genetische Unterschiede zu identifizieren. Identifizierung von Genaktivität für • Embryonalentwicklung • Krebsentstehung Identifizieren von Unterschieden im Genom • verschiedener Stämme von Bakterien • komplexer eukaryotischer Lebewesen
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Biotechnologie in menschlichen Kulturen
• unkontrollierte Fermentation • 6000 v. Chr. Alkoholische Getränke im Zweistromland Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln
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Notwendigkeit zur Diagnose
• genetische Identität • Stabilität von Starterkulturen • hygienische Risiken • wirtschaftliche Effizienz routinemäßige Verifikation durch genetische Fingerabdrücke
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Notwendigkeit zur Diagnose
• Fingerprinting
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Notwendigkeit zur Diagnose
• Verständnis probiotischer Eigenschaften
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Anwendbarkeit der SSH Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren Um darauf aufbauend a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren
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Subtraktive Hybridisierung
dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen
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Subtraktive Hybridisierung
gezielte Identifikation von Unterschieden besonders vorteilhaft
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Subtraktive Hybridisierung
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Subtraktive Hybridisierung
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Subtraktive Hybridisierung
Ausgangs- material
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Fragmentieren
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Mischen
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Denaturieren
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Hybridisieren
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Isolieren
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wichtige Entwicklungsschritte
Entwicklungen innerhalb der „Subtraktiven Hybridisierung“ betrafen die Isolierung der stammspezifischen, einzelsträngigen DNA a) Immobilisierung b) Suppression Effekt
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Isolierung durch Immobilisierung
Immobilisierte Subtraktor-DNA
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Isolierung durch Immobilisierung
Zugegebene, denaturierte Proben-DNA
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Isolierung durch Immobilisierung
Homologe DNA-Fragmente werden dem Überstand entzogen
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Suppression Subtractive Hybridization
Verwendung von Adaptoren Vorteile: Geringste Mengen 2) Suppression Effekt
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Suppression Effekt
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Vorteile der SH/SSH • Geringe Materialanforderungen (PCR) • bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar • Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome • Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes
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Bisherige Anwendung Genomanalysen im medizinischen Bereich: • Identifikation von Virulenzgenen • neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen • Antibiotikaresistenzen • Oberflächenstrukturen • PAIs: „pathogenicity islands“
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Praktische Ergebnisse
Anwendung auf Milchsäurebakterien Lactococcus St Lactococcus St • Isolierung der unterschiedlichen Regionen: • Funktionen der unterschiedlichen Regionen • Stammspezifische PCR-Systeme • Suche nach Eigenschaften in anderen MOs
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Anreicherung stammspezifischer Fragmente
1526 – 1760 = ? 1760 – 1526 = ?
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Gefundene Unterschiede
Lactococcus Stamm 1760 • A2: Bacteriocin-Produktion • A5: Funktion unbekannt Lactococcus Stamm 1526 • A22: zellwandassoziierte Proteinase • A23: Restriktionsmodifikationssystem [subunit (hsdS) gene]
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PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme
A2: Nisin A5: ? A22: Proteinase A23: hsdS Nisin Proteinase hsdS ? 1526 1760
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PCR-Systeme auf weitere Stämme
89 bp: ? 166 bp: Proteinase 271 bp: hsdS 322 bp: Nisin
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Weitergehende Anwendungen
Identifizieren von probiotischen Eigenschaften • größere Überlebensrate • dauerhafte Ansiedlung • Reduktion von mutagenen Enzymen • Stimulation von Makrophagen Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress
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Danke Danisco Cultor Niebüll GmbH Dr. Udo Friedrich PD Dr. Winfried Hausner
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Wir haben einen Überschuss an einfachen Fragen und einen Mangel
Noch Fragen? Wir haben einen Überschuss an einfachen Fragen und einen Mangel an einfachen Antworten. Lothar Schmidt
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Immer noch Fragen? Gott weiß alles, sagt es aber nicht. Ich weiß nichts und sage alles. unbekannt
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Suppression Subtractive Hybridization
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Suppression Subtractive Hybridization
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Suppression Subtractive Hybridization
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