MIN – Untersuchungen beim sporadischen Nierenzellkarzinom Zwischenergebnisse • Was ist Mikrosatelliteninstabilität (MIN) ? • Was ist Alu/AP - PCR ? • Methoden/ Materialien • Ergebnisse • Ausblicke
Was ist Mikrosatelliteninstabilität ( MIN ) ? Mikrosatelliten: kurze polymorphe Tandemrepeats,1% des Genoms Mono-,Di-,Tri-,Tetra - Nukleotidsequenzen 10-50 Kopien von 1-6 Basenpaarmotiven ( Cunningham et al. IOS Press, 1999) treten ungefähr aller 100000 Basenpaaren einmal auf fungieren vermutlich als Promotoren, Bindungsstellen für Topoisomerasen Relativ konstant übers Genom verteilt, zu 90 % heterozygot, Brauch et al. Vorwiegend in intronischen DNA - Abschnitten gelegen Längenveränderungen dieser DNA – Abschnitte (MIN/ Replication Error Phänotyp) verweisen auf genetische Instabilität Expansionen/ Kontraktionen während Replikation
Replikation Expansion Fehlpaarungen (Mismatches) Kontraktion
Historie von MIN MIN wird ursprünglich 1993 beim HNPCC - Syndrom (hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom) beschrieben (Aaltonen et al. Science 260; Ionov et al.Nature 363, Thibodeau et al. Science 260) HNPCC assoziierte Tumore weisen zu 80 - 90% MIN auf Physiologisches Auftreten von Fehlpaarungen (Mismatches) im Bereich einfach - repetitiver Sequenzen während der DNA - Replikation bei Bakterien/ Hefen Mismatch-Reparaturenzyme korrigieren Replikationsfehler 6 DNA - (mismatch) Reparaturgene 3 homolog zum bakteriellen MutS: hMSH2, hMSH3, hMSH6 3 homolog zum bakteriellen MutL: hMLH1, hPMS1, hPMS2
Historie von MIN 1993 Klonierung des ersten Mismatch-Repairgen hMSH2 (Fishel et al) aus Kolonkarzinom - DNA Keimbahnmutation ist wesentlicher Faktor für HNPCC - Syndrom Voraussetzung für MIN - positive Karzinome ist Inaktivierung beider Allele eines Mismatch-Repairgens (“two – hit” Modell nach Knudson, PNAS 68) Diagnostik bei HNPCC mittels MIN - Analyse mit immunhistochemischer Repairgen - Expressionsbestimmung (anti - hMSH2, anti - hMLH1 am Tumor) : positiv Sequenzierung von hMSH2, hMLH1 in Normal - DNA 5 Mikrosatelliten: BAT 25, BAT 26, D5S346, D17S250, D2S123
MIN in Nicht - HNPCC assoziierten sporadischen Tumoren Modifiziert nach Cunnigham et al. IOS Press 1999
Methoden und Materialien AP - PCR: Unterschied zu gewöhnlicher PCR: Generierung einer reproduzierbaren Schar von Produkten (genomischer DNA- Fingerabdruck) mit einem Primer Voraussetzung: Alu- Verdau, ~ 450 bp große Fragmente Alu - Sequenz: 5% des Genoms, assoziiert mit 50 - 80% bestimmter Mikrosatelitten am 3 ‘ Ende auf somatische Mutationen von Di- und Trinukleotiden treten mit veränderten Alu - Sequenzen auf Sood und Buller (Oncogene 13): 36 von 68 Ovarialtumoren mit MIN weisen veränderte Alu/ AP - PCR Bandenmuster Blut - DNA
Methoden und Materialien Ablauf: DNA - Isolation aus Gefriermaterial mittels Salzextraktion (Tumor-, Normalgewebe) Konzentrationsmessung a) 20 ng - Verdünnung für Mikrosatelitten - PCR b) DNA - Verdau mit ALU 1 für AP - PCR c) Kontrolle der PCR - Produkte im Agarose - Gel Denaturierung mittels Hitze und Formamid - Puffer Auftragen der PCR - Produkte auf PAA - Gel mit anschließender Silberfärbung Vergleich des Bandenmusters von Normal- und Tumorgewebe Probleme: nach absoluten Schwierigkeiten mit AP - PCR muß diese für die ersten 100 Patienten abgearbeitet werden
Methoden und Materialien Christian Höfling: Methoden und Materialien Einsatz von 6 Mikrosatellitenmarkern: Dietmaier et al. Cancer Res 57, 1997
Ergebnisse 40 Patienten mit 5 Markern untersucht BAT 25, Bat 26, REN, MYCL1, tp53Alu (RB wird optimiert) Patient 13 und 40 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig ab Patient 41 nur noch: REN, MYCL1, tp53Alu 100 Patienten mit MYCL1 und tp53Alu untersucht nur noch Patient 41 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig (REN steht bei Patient 72) AP – PCR: PCR klappt nach größeren Problemen Auftragen der Proben auf PAA – Gel zeigt erwartetes Ergebnis
MYCL1 Ergebnisse T 13 N 13 T 14 N 14 MIN bei Pat. 13, 40, 41 auffällige Marker: tp53Alu MYCL 1 MYCL1 Expansion LOH T 13 N 13 T 14 N 14 Vergleich +/ - MIN bei Pat.13/ 14
tp53ALU MYCL1 Ergebnisse AP - PCR T 41 N 41 T 41 N 41 LOH shift
Ergebnisse Verdünnungsreihe der PCR - Produkte für tp53Alu (µl PCR - Produkt zur Fällung) 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5 750 ng 500 ng 250 ng 125 ng 63 ng N 40 T 40 von 50 µl Gesamtansatz Standards 100 bp Leiter 10 µl auf PAA - Gel 10 µl auf Agarosegel sensitiver Nachweis von gemischten DNA - Mengen möglich (schwache PCR - Produkte sind nicht kritisch für MIN - Nachweis)
Ergebnisse 1:100 Einsatz eines alten PCR - Produktes als Template in neue AP - PCR altes PCR - Produkt wurde verdünnt: 1:10 1: 50 1: 00 jeweils 2 µl von Verdünnung eingesetzt Resultat: reproduzierbares Bandenmuster unabhängig von Templatemenge stabile Nachweismethode genetischer Instabilität 1:10 1:50
Ausblicke Verwendung neuer Marker im Bereich von Tumorsuppressorgenen des Chromosoms 3: 2 Marker der VHL - Region D3S1560, D3S1317 2 Marker der FHiT - Region D3S1300, D3S4260
Ausblicke Auskunft über postoperative klinische Daten Rückantwortbrief an niedergelassenen Urologen/ Hausarzt (Korrelation zw. Patientenkarriere und MIN ?) Immunhistochemie der Mismatch - Reparaturenzyme Zusammenarbeit mit Thomas mRNA - Expressionsprofile: Wahrscheinlichkeit einer umfassenden genomischen Instabilität von bekannten Markern anvisiertes Ende der Experimente: Ende 2002