Molekulargenetische Diagnostik

Präsentation zum Thema: "Molekulargenetische Diagnostik"—  Präsentation transkript:

1 Molekulargenetische Diagnostik
Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple kartilaginäre Exostosen) DNA-Sequenzanalyse (direkte Diagnostik) (Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom) MLPA (direkte Diagnostik, Retinoblastom) (D. Lohmann) H.-J. Lüdecke

2 Retinoblastom

3 Familienanamnese bei Retinoblastom
Familie L.B. Familie J.W. Familie L.S.

4 Erbliches Retinoblastom
Keimbahn konstitutionell Tumor erste Mutation zweite Mutation rb X RB RB rb rb rb rb RB Gameten

5 Retinoblastomgen Genomische DNA 1 2 3 6 7 17 18 27 5´ 3´ Intron Exon
Beispiele für Mutationen in kodierenden Bereichen

6 Segregation

7 Indirekte Diagnostik: Segregation gekoppelter Marker

8 VNTR-Polymorphismus 5´ 3´
ggtgtacgtc tatacagggc tatgtataac cgactcctgt ttctcctccc tgcaaccaca gaaccatcac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacggatac acgcacagat acgctccttt ccacaaatgc acgcaaaccg ggacgcaaac ccacaactcg agggcttaga ccttcactgc

9 Intragene VNTR-Loci D13S153 (RBi2) RB1.20 VNTR-Loci
5´ 3´ D13S153 (RBi2) RB1.20 VNTR-Loci ... CA GT ... ... CTTT GAAA ... n n

10 Genotypisierung RB1, väterliches Allel RB1, mütterliches Allel CA GT
20 CTTT GAAA 14 CA GT 18 CTTT GAAA 19

11 Kopplungsphase RB1, mutiert 4bp Deletion Exon 4 CTTT GAAA 14 CTTT GAAA
19

12 Kopplungsphase Rb1.20- Genotyp 15-18 14-20 14-18 18-20 14-16

13 Kopplungsphase Rb1.20- Genotyp 15-18 14-20 14-18 18-20 14-16 4bp
Deletion Exon 4 CTTT GAAA 14

14 Analyse von VNTR-Loci PCR oder
5´ 3´ PCR oder Fragmentlängenanalyse durch elektrophoretische Auftrennung

15 Gelektrophorese

16 Agarosegel in Elektrophresekammer
Anode (–) Kathode (+)

17 Auftragen der Proben

18 Elektrophoretische Auftrennung

19 Dokumentation per Videobild

20 Dokumentation

21 Genotypisierung Rb1.20- Genotyp 2-4 1-5 1-4 4-5 I-1 I-2 II-2 II-3
1-3

22 Familie I 1 1 1 1

23 Familie I 1-2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2

24 Familie I 1-2 3 2-3 1 2-3 3 3 2-3 3 3 3 3 3 3

25 Familie I 1-2 3-4 2-3 1-4 2-3 3 3 2-3 4 4

26 Familie I 1-2 3-4 2-3 1-4 2-3 3-5 3-5 2-3 5 5

27 Familie I 1-2 3-4 2-3 1-4 2-3 3-5 3-5 2-3

28 Familie 2 1-3 2-3 1-3 2-3

29 Familie 3 3 1-4 4-5 2-4 1-5 3-4 1-5 2-4 4-4

30 Familie 4 4 2-4 2-3 2-4 3-4 1-3 2-4 2-3

31 Prädiktive Diagnostik bei Locusheterogenität
Segregationsanalyse bei hereditären multiplen cartilaginären Exostosen (HME) Hermann-Josef Lüdecke

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34 Lokalisierung der Exostosen

35 Multiple cartilaginäre Exostosen
Häufigkeit 1 : Penetranz  100 % autosomal dominant genetisch heterogen 8q EXT1 11p EXT2 (19p EXT3)

36 Spektrum der Mutationen in EXT1 und EXT2
Wuyts & van Hul, 2000

37 und Segregationsanalyse mit EXT1- bzw. EXT2- intragenen
Kopplungsanalyse und Segregationsanalyse mit EXT1- bzw. EXT2- intragenen Mikrosatelliten-Markern

38 genomische Organisation des EXT1-Gens

39 Kopplungsphase: EXT2, Allel 2 kein Risiko Risiko: M P P P GP P P P 1 2
3 4 5 P P GP P M P P P Kopplungsphase: EXT2, Allel 2 Risiko: kein Risiko

40 Übungsaufgaben

41 P 1 2 3 4 P P EXT1, Allel 2 kein Risiko für III2

42 1 2 3 P P P P keine Aussage möglich

43 1 2 3 4 5 P P P EXT2, Allel 2 Individuum III2 wird erkranken

44 Fehlen paternaler EXT1-Allele
M P P ? ? M M M P P P M Fehlen paternaler EXT1-Allele

45 y935A12 y960B10

46 der(5) der(5) 5 5 8 der(8) Sonde: "paint 5" Sonde: y960B10

47 Molekulargenetische Diagnostik durch DNA-Sequenzanalyse

48 Punktmutationen THE CAT DID EAT THE RED HAT THE RAT DID EAT THE RED HAT THE ATD IDE ATT HER EDH AT THE CHA TDI DEA TTH ERE DHA T

49 1. Enzymatische Vermehrung des zu untersuchenden Genabschnittes mittels PCR
Cave: Es werden immer das maternale und paternale gemeinsam amplifiziert!

50 2. Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
Template (Matrize) 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' Primer (Startmolekül) 5'-AAGTCATTGC-3' Primer-Annealing (Anlagerung) 5'-AAGTCATTGC-3' 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' DNA-Polymerase dNTPs ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP Primer-Verlängerung und Kettenabbruch

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52 Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
Template (Matrize, einzelsträngig) 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' Primer (Startmolekül) 5'-AAGTCATTGC-3' Primer-Annealing (Anlagerung) 5'-AAGTCATTGC-3' 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' DNA-Polymerase dNTPs ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP Primer-Verlängerung und Kettenabbruch 5'-AAGTCATTGC TACGTAACT 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' 5'-AAGTCATTGC TACGTAACTG 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' 5'-AAGTCATTGC TACGTAACTGA 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' 5'-AAGTCATTGC TACGTAACTGAC 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'

53 Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
hier sind einmal alle Produkte der Primer-Verlängerung gezeigt: 5'-AAGTCATTGC-3' 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' DNA-Polymerase dNTPs ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP Primer-Verlängerung und Kettenabbruch 5'-AAGTCATTGCT 5'-AAGTCATTGCTA 5'-AAGTCATTGCTAC 5'-AAGTCATTGCTACG 5'-AAGTCATTGCTACGT 5'-AAGTCATTGCTACGTA 5'-AAGTCATTGCTACGTAA 5'-AAGTCATTGCTACGTAAC 5'-AAGTCATTGCTACGTAACT 5'-AAGTCATTGCTACGTAACTG 5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGA usw.

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55 Gelelektrophorese Kapillarelektrophorese

56 manuelle Beladung der Gele
automatische Beladung der Kapillaren

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58 Patient A G C T N CGA TGA Normalperson A G C T

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60 Tricho-Rhino-Phalangeale Syndrome
8 Klinische Zeichen: dünnes, spärliches Kopfhaar große, "birnenförmige" Nase langes, flaches Philtrum schmales Oberlippenrot Zapfenepiphysen Brachydaktylie Hüftveränderungen Kleinwuchs multiple cartilaginäre Exostosen (nur TRPS II) TRPS1 EXT1

61 Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom
An dieser Stelle wurde im Praktikum das Foto einer Patientin gezeigt. Dieses darf jedoch nicht im Internet veröffentlicht werden. Ich hoffe, Sie haben sich die Charakteristika des TRPS einprägen können.

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64 Struktur des TRPS1 Transkriptionsfaktors
3 4 5 6 7 N C Exon 6

65 Sequenzierung von Exon 6 des TRPS1-Gens
CGA  CAA; Arg  Gln; R  Q

66 Übungsaufgaben

67 Patient 1 Normalperson C G T A N A C C C G G T G T T T T T T G T G C C

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69 Patient 1 Normalperson C G T A N A C = Thr = Pro C C G G T G T T T T T

70 Struktur des Zinkfingers vom "GATA"-Typ
R R R G S G V F C A N L T K S W R G Y V G L Y Q K L H S Zn P NH2 COOH

71 aus: Vilain et al. (1999) Am J Med Genet 85:495-497

72 Patient 2 C A G T N Normalperson C A G T

73 Patient 2 Normalperson C A G T N Wildtyp: G T C A mutant: T G C A C A
T-Insertion C A G T

74 Patient 3 C T G A N T A = Stop Normalperson C T G A

75 Patient 4 A G C T N g t a Normalperson A G C T

76 RNA - Spleissen Wildtyp Mutation eines Spleiss-Signals

77 N C 3 4 5 6 7 Wildtyp-TRPS1 IVS6+1G>T  exon6-TRPS1 1281 aa

78 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplication (MLPA)

79 SALSA MLPA probes

80 Beachte den Unterschied
Hybridisierung Der MLPA Sondenmix wird zu denaturierter genomischer DNA gegeben Die zwei Teile jeder Sonde hybridisieren mit benachbarten Zielsequenzen Beachte den Unterschied

81 Ligation 3. Die Sonden werden mit Hilfe einer thermostabilen Ligase verbunden (ligiert)

82 Fluoreszenzfarbstoff
Amplification Mit einem universellen Primerpaar kann man alle ligierten Sonden amplifizieren Das Amplifikationsprodukt jeder einzelnen Sonde hat eine genau definierte Länge ( bp). Fluoreszenzfarbstoff

83 bp NP1 NP2 Patient 1 Patient 2 Patient 3 1 10 20 30 40