Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation Vorteile eines colorimetrischen „Array-in-Well“ Assays, dargestellt am Beispiel der Multiplexed Diagnostik der Atemwege. Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation

Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay-Entwicklung und Validierung an Patientenproben 2

Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay Entwicklung und Validierung an Patientenproben 3

Multiplexed Diagnostics Multiplexing Trend zur personalisierten Medizin erfordert bessere, mehr und häufigere diagnostische Untersuchungen Simultane Messung verschiedener Parameter in einer Probe Proteine, DNA Etablierte Multiplexing Techniken: Planare Microarrays hoher Dichte: DNA arrays Bead-basierter Ansatz mit Durchflusszytometrie (bis zu100-plex) Unser Ansatz: Planare Microarrays in 96 Well Platten Arrays geringer Dichte (z.B. 9 bis ca. 144 Spots pro Microarray) Ideal für den Nachweis von Protein-Markern, Genotypisierung Colorimetrische- und Fluoreszenz Detektion Multiplexed Diagnostics

Multiplexen in der Diagnostik Multiplexing ist sinnvoll wenn: Das diagnostische Panel vernünftig zusammengestellt ist, zielgerichtet und effizient ist Detektion verschiedenen Virus-Stämme, mehrere Marker einer Krankheit etc… Über das Gesundheitssystem abgerechnet werden kann Nicht schwieriger handhabbar ist als ein Einzeltest Z.B. ein Assay in einer 96-well-Mikroplatte Er zusätzlichen Nutzen für ein Labor bringt Z.B. Kostenersparnis Laborarbeit oder Reagenzien Hürden: Verfügbarkeit einer robusten, kompakten und erschwinglichen Detektion Spotting Technologie

CLAIR®: Colorimetric Array Imaging Reader für Microarrays CCD-basierter Imaging Reader Geeigent für IVD Eigenständiges Gerät Mit eingebautem Rechner, Kontroll-Software, Touch- Screen und integrierter Spot Auswertung Für die quantitative Auswertung von Microarrays Spot Größen von 50 – 500 µm Schnelle Bildaufnahme Ca. 2 Minuten pro Mikroplatte Flexible Probenformate 96-well Platte, Strip-well Platte, Objektträger

CLAIR – Anwendungsbeispiel HPV Genotypisierungs-Assay Zur Differenzierung von onkogenen / harmlosen HP-Viren Grippe-Viren Genotypisierungs Assay Zur Diagnose unterschied-licher Grippe-Viren This is a second application - HPV detection HPV infection primary cause of cervical cancer, 2-20% of women worldwide are infected with HPV. Different HPV genotypes have different risks, co-infection of different genotypes increases risk  early detection of the specific genotype(s) is critical to avoid cancer. Here you see 35 HPV genotypes in one reaction tube. The genotypes are classified either as low or high risk. The assay is a genotyping assay, specific fragments of the viral genome are amplified and then hybridization with specific probes for each HPV type are measured. This makes it possible to detect infections and co-infections of up to 35 HPV genotypes in only one tube. This approach presents a number of advantages: · Its high sensitivity allows detection of minimal quantities of viral DNA. · Its high specificity allows detection of specific HPV genotypes by recognizing a highly conserved sequence of the viral genome. · The test can be easily performed in hospital laboratories. · It can quickly detect the presence of up to 35 of the most clinically relevant HPV types within hours. Each tube contains triplicates for each probe to avoid that transient alterations of the spots that could affect the final results. In addition, one array contains the following controls: Genomic DNA control: Assures presence of DNA in the sample.  Internal amplification control: Verifies the correct amplification reaction in each sample. The somewhat crumpled spots show you the actual picture taken and the result box below the customer’s interface for reporting the results to the physician. 7 7

Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay Entwicklung und Validierung an Patientenproben Durchgeführt in Zusammenarbeit mit VTT, Turku, Finland 8

Multiplexed diagnostischer DNA assay Multiplexed Assay Multiplexed diagnostischer DNA assay Microarray Matrix von Genen / Oligonucleotiden Multiplexed diagnostischer Immunoassay Microarray Matrix von Antikörpern / Antigenen Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

„Arrays in Well“ Plattform mit fluorogenen oder colorimetrischen Substraten Arrays in Well (AIW) Microarrays in 96-Well Platten Multi-Analyt basierte Bioassays im einfachen und vertrauten Mikroplatten Format (C) 2009 Sensovation AG

Vorteil eines Multiplexed Assays

Prinzip: Array in Well

Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie Direkte Fluoreszenz Markierter Antikörper Antigen Fänger Antikörper Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie Verstärkte (Amplified) Fluoreszenz (Tyramide) HRP HRP CY3 CY3 HRP CY3 CY3 H202 Markierter Antikörper CY3 Antigen Fänger Antikörper CY3 CY3 CY3 CY3 CY3 Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie HRP HRP HRP TMB TMB TMB TMB H202 Markierter Antikörper TMB Antigen TMB TMB TMB Fänger Antikörper TMB TMB TMB Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

Reader Technologie: CLAIR Tecan LS400 Modell Assay Technologie Vergleich anhand eines Modell Assays: CLAIR vs. Confocal Scanning Färbe Technik: Colorimetrie im Vergleich zu direkter Fluoreszenz im Vergleich zu verstärkter Fluoreszenz Reader Technologie: CLAIR Tecan LS400 =>CCD-Imager Laser Scanner Modell Assay Adenovirus Hexon Protein (Virus Antigen) Verdünnungsreihe von 156 ng/ml bis 0.0009 ng/ml, plus Leerwert Multiplexed Sandwich ELISA Doppelbestimmung Jedes Näpfchen enthielt eine Anordnung von 3 x 3 Spots Array Layout

CLAIR Konfokaler Scanner, Bilder Colorimetrische Detektion Direkte Fluoreszenz Verstärkte Fluoreszenz Note: please note that the fluorescent images are rotated by 90 degrees vs the colorimetric data.

CLAIR Konfokaler Scanner, S / N Vergleich Färbung / Reader Verstärkte Fluoreszenz (Cy3) ist die empfind-lichste Methode, Detektionsgrenze: 0.016 ng/ml Direkte Fluoreszenz (Dy633) ist etwa 2x weniger empfindlich TMB Assay Detektions-grenze: 0.041 ng/ml. Schlussfolgerung: Cy3/TECAN doppelt so empfindlich wie Dy633/TECAN welche doppelt so empfindllich ist wie TMB/CLAIR.

CLAIR Konfokaler Scanner, Diskussion Empfindlichkeit: Colorimetrischer TMB-Assay ist nur ca. 2-mal bzw. 4-mal weniger empfindlich als direkte / verstärkte Fluoreszenz Dynamischer Bereich: Colorimetrischer Assay hatte eine sehr gute Linearität über 2 Größenordnungen Verstärkte Fluoreszenz hatte einen geringeren dynamischen Bereich als die colorimetrische Messung Direkte Fluoreszenz hatte eine gute Linearität über 3 Größenordnungen Beachte: Dieser Vergleich beinhaltet Färbetechnik, kombiniert mit Detektionstechnik: High End Forschungs - Scanner (Fluoreszenz) gegenüber einem Routine-Reader (Colorimetrie)

Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay Entwicklung und Validierung an Patientenproben Durchgeführt in Zusammenarbeit mit VTT, Turku, Finland 20

Multiplexed Virus Assay Test von Grippeviren Multiplexed Analyse von 7 Grippeviren Sandwich ELISA Assay Colorimetrisches Auslesen mit CLAIR Reader Verdünnungen von Virus-Infiziertem Zell-Lysat Array Layout Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

Multiplexed Virus Assay, Bilder Beispiele Inf = Influenza PIV = Parainfluenza RSV = Respiratory Syncytical Virus Schlussfolgerung: Mit dem multiplex Assay konnten alle 46 analysierten Virus-Proben detektiert und korrekt klassifiziert werden. Das Auslesen und die Auswertung mit CLAIR war schnell und einfach. Die Analytik ist einfach automatisierbar.

Analyse klinischer Proben Analyse der genannten Grippeviren in 88 klinischen Patientenproben mittels eines multiplex Assay Die Patientenproben wurden parallel analysiert Mittels colorimetrischer TMB-Detektion (CLAIR) Mittels verstärkter Fluoreszenz (Laser Sanner, TECAN) Die Pateintenproben waren zuvor mittels TR-FIA getestet worden: 44 Proben waren Antigen-negativ, 44 waren Antigen-positiv: Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

Analyse klinischer Proben Array Layout Jeder Fänger-Antikörper wurde 6 mal gespottet: Drei Spots mit hoher Antikörper- Dichte Drei Spots mit geringerer Antikörper- Dichte Erhöhung des dynamischen Bereichs, da einige Proben mit hoher Antigen Konzen-tration Kreuzreaktion zeigten Positive Kontrollen in allen vier Ecken Dienen auch als Referenz-Spots für das Grid bei der automatischen Auswertung

Analyse klinischer Proben, Bilder Direkter Vergleich TMB/CLAIR und Cy3/TECAN

Analyse klinischer Proben, Ergebnisse Colorimetrische Detektion (CLAIR) lieferte vergleichbare Ergebnisse zu dem Fluoreszenz-Test (verstärkte Fluoreszenz), gemessen mit dem Tecan LS400 Tecan / Fluoreszenz charakterisierte 82 von 88 Proben richtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) CLAIR / Colorimetrie charakterisierte 77 von 88 Proben richtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) Alle falsch charakterisierte Proben waren PIV 3 Proben, die offenbar mit der Zeit degradiert waren (TR-FIA Messungen fanden mehrere Wochen früher statt) Mit Fluoreszenz wurden die Proben gerade über dem “Cut-Off” gemessen Mit Colorimetrie wurden die Proben gerade unter dem “Cut-Off” gemessen  Die genaue Antigen-Konzentration zum Zeitpunkt dieses Experi-mentes ist unbekannt und könnte unter dem “Cut-Off” gelegen haben

Zusammenfassung Colorimetrische Detektion ist im Ergebnis vergleichbar mit Fluoreszenz-Detektion (verstärkte Fluoreszenz) Vergleichbare Empfindlichkeit und Linearität Fluoreszenz Assays können einfach in colorimetrische Assays “umgebaut” werden Colorimetrische Assays und die dafür notwendigen Geräte sind weniger komplex und preisgünstiger als die entspechenden Fluoreszenz-Geräte Colorimetrische Assays sind ideal für die Routineanalytik in klinischen Labors, Veterinärmedizin und Lebensmittel-analytik

Besuchen Sie uns auf der Analytica Halle 2, Stand 524 Danke für Ihr Interesse!