Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien Doreen Kunze Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden

Ziele 1.Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene 2.Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK 3.Hormonabhängigkeit der P38IP-mRNA- Expression

1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung) Prostatakarzinom (PCa) häufigste Krebserkrankung bei Männern zweithäufigste Krebs-Todesursache Lebenszeitrisiko: –Zu erkranken: 9,6 % –Zu sterben: 3,2 % Häufigkeitsgipfel zw. 70 – 75 Lebensjahr genetisch sehr heterogen

1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung) P38IP C13ORF19, Fam48A lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen mRNA-Expression im PCa reduziert Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe: verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression Chromosom RB1 C 13 BRCA2 In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP Schematische Darstellung des längsten offenen Leserahmens im P38IP-Gen und das abgeleitete Proteinmuster. PEST-RegionKernlokalisierungssignal Glutamin-Cluster  -Helix-Region 733 AA C N

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse: h nach TF-Start siRNA- D1 siRNA- D2 siRNA- D3 siRNA- D4 siRNA- D %49 %22 %55 %12 % 2450 %58 %40 %56 %16 % 4845 % 32 %67 %23 % 7256 %50 %36 %93 %31 % Aussaat (PC-3, BPH-1) Transfektion (4 h) 24 – 72 h WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest Western Blot 20 – 68 h Tf mit 250 nM siRNA: 24 h nach Tf:

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse) unbehandelt 48 h siRNA-D5 48 h 5,5 % ns-siRNA 48 h 4,9 %4,3 % Apoptosemessung (FACS) - Tf mit 125 nM siRNA Zellkoloniebildungstest WST-Test 48 h nach Tf

1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)  langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression  keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte

1.2 Chemoprotektion (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse: CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h) Aussaat (PC-3) Transfektion (4 h) 24 – 72 h20 h WST-1-Test Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest 24 – 72 h WST-1-Test: 96 h nach Tf

1.2 Chemoprotektion (Ergebnisse) A B 125fache Vergrößerung A: PC-3 siRNA-D5 B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid  Zellzyklusarrest, keine Apoptoseinduktion

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Einleitung) P38IP = p38MAPK interacting protein MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase intrazelluläre Signalübertragung (Proteinkinasen-Kaskaden) streßaktiviert 4 Isoformen (α, β, γ, δ) SB inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse: Aussaat (PC-3, BPH-1) DMEM ohne FKS 24 – 72 h Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Western Blot (HSP27) 10 – 60 min SB (0,5 – 8 µM)  kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK erkennbar

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse, Ausblick) Ergebnisse: HSP 27 ß-Actin  HSP27 ist kein geeigneter Nachweis für p38MAPK-Inhibition Ausblick: Einfluss von siRNA-D5-Behandlung auf p38MAPK ? (Western Blot mit AK gegen p38MAPK)

3. Hormonabhängigkeit (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse:  P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig AussaatHormonfreies Medium 24 h 3 – 48 h Androgen R1881 (+ Casodex) 24 h RNA-Isolierung + qPRC

Zusammenfassung Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !  langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression  keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte  kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK  P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig