Sequentielle Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen zur Regeneration von Knochen als Imitation der enchondralen Ossifikation E. J. Hübner1, P. Niemeyer1, N. P. Südkamp1   1 Albert-Ludwigs-Universität, Universitätsklinikum Freiburg, Department Orthopädie und Traumatologie, Freiburg, Deutschland Fragestellung Humane mesenchymale Stammzellen stellen eine für das Tissue Engineering von Knochen viel versprechende Zellpopulation dar. Trotz erfolgversprechenden ersten Arbeiten sind jedoch in vitro präformierte Konstrukte aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) derzeit dem Goldstandard der autologen Spongiosaplastik bezüglich ihrer osteogenen Regenerationskapazität zumeist noch unterlegen1,2. Orientiert am physiologischen Vorbild der enchondralen Ossifikation war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Evaluation eines sequentiellen chondro-osteogenen Differenzierungsprotokolles zur Verbesserung des osteogenen Potenzials stammzellbasierter Tissue Engineering-Konstrukte3. II. Material und Methoden Nach Isolation von Knochenmarkaspiraten (n=4) und in vitro Expansion wurden die MSC in high-density Pellet-Kulturen verbracht und für 28 Tage entsprechend unterschiedlicher Differenzierungsprotokolle behandelt. Die Zellen wurden für 1 (Gruppe A), 14 (Gruppe B) bzw. 28 Tage (Gruppe C) chondrogen und im Anschluss 27 (Gruppe A) bzw. 14 Tage (Gruppe B) osteogen differenziert. Alle Gruppen wurden histologisch mittels Hemalaun Eosin-, Von Kossa- sowie Safranin-Färbungen untersucht. Die Quantitative Auswertung der Expression chondrogener sowie osteogener Markergene (Col2, Col10, COMP, Col1, BMP 2, Alkalische Phosphatase, Osteocalcin) erfolgte mittels real-time PCR. Zur Evaluation der phänotypischen Stabilität der gewonnenen osteogenen Matrixkonstrukte in Abwesenheit weiterer osteogener Stimuli wurden erste in vivo Untersuchungen in einem modifizierten Chorioallantois-Membran (CAM) - Modell des bebrüteten Hühnereis durchgeführt. Zellpellets der Gruppe B wurden nach sequentieller chondro-osteogener Differenzierung in vitro ohne Zugabe weiterer osteogener Medien auf die CAM transplantiert und nach 8 Tagen histologisch sowie molekularbiologisch untersucht. Abb. 3: Quantitative Genexpression nach 28 Tagen als Vielfaches der Genexpression in Expansionsmedium an Tag 1 Abszisse: Versuchsgruppen (A: 1d chondrogen und 27d osteogen induziert; B: 14d chondrogen und 14d osteogen induziert; C: 28d chondrogen induziert; Kontrollgruppe: 28d osteogene Induktion in Monolayer-Kultur), Ordinate: Vielfaches der Genexpression undifferenzierter MSC kultiviert in Expansionsmedium an Tag 1 HE-Färbung mit z.T. einsprossenden galinen Gefäßen links: Lichtmikroskop 10x rechts: Lichtmikroskop 20x Von Kossa Färbung: Anfärbung osteotypischen Calciums/Calciumsalzes links: Lichtmikroskop 10x rechts Lichtmikroskop 40x Anti-(humanes)-Vimentin Färbung: Nachweis von homogen verteilten, humanen Zellen nach mehr als 5 Wochen Kulturdauer links: Lichtmikroskop 10x rechts: Lichtmikroskop 40x Abb. 4: MSC nach 14d chondrogener und 14d osteogener Induktion in vitro, anschließend 7d Kultur ohne osteogenen Stimulus auf der CAM. IV. Diskussion Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung und der Nachweis eines sequentiellen, chondro-osteogenen Differenzierungspotenzials humaner mesenchymaler Stammzellen in Anlehnung an die physiologische Knochen(neu)bildung durch enchondrale Ossifikation. Gezeigt werden konnte, dass mesenchymale Stammzellen ihr osteogenes Potenzial auch nach initial chondrogener Induktion beibehalten und in vitro nach einer Kulturdauer von bis zu 28 Tagen einen stabilen osteogenen Phänotyp ausbilden. Durch eine chondrogene Prädifferenzierung kommt es zu einer spontanen dreidimensionalen Anordnung der Zellen in Form eines Zellpellets, das auch während einer folgenden osteogenen Induktion stabil bleibt4. Die dreidimensionale Matrixeinbettung der Zellen scheint sich im Vergleich zur osteogenen Monolayer-Kultur mesenchymaler Stammzellen positiv auf die osteogene Potenz auszuwirken5. Bezüglich der Fragestellung, ob nach sequentieller in vitro Differenzierung ein stabiler Phänotyp resultiert oder ob ohne persistenten osteogenen Einfluss eine Tendenz zur Redifferenzierung der Zellen besteht, wurden erste semi-in vivo-Versuche im bebrüteten Hühnerei-Modell auf der Chorioallantois-Membran mit Zellpellets nach 14 Tagen chondrogener sowie 14 Tagen osteogener Prä- Differenzierung in vitro durchgeführt. Die auf der Chorioallantois-Membran adhärenten Zellkonvolute präsentierten sich nach einwöchiger Inkubation in vivo ohne extern hinzugefügten osteogenen Stimulus in stabiler Pelletform, mit in histologischen Auswertungen deutlich nachweisbaren osteogenen Anteilen, im Sinne eines stabilen osteogenen Phänotyps der Zellen. Weitere Versuche bezüglich der Zellvitalität, der phänotypischen Stabilität der differenzierten Zellen sowie deren Verhalten im in vivo setting sind nötig, um die Sicherheit für eine klinische Anwendung des viel versprechenden Ansatzes zu gewährleisten. Abb. 1a-f: Arbeitsschritte des CAM-Modells. a) Eieröffnung mittels Handsäge b) Präparation einer kreisrunden Zylinderöffnung c) Area vasculosa am 3. Inkubationstag d) Zylinder- und Pelletimplantation am 7. bzw. 8. Inkubationstag auf die CAM e) Verschluss der Zylinderöffnung und Reinkubation f) Aufbringen der Pellet-CAM-Konstrukte auf Zellfilter zur histologischen Aufarbeitung III. Ergebnisse In den histologischen Ergebnissen zeigten sich die Pellets der Gruppe B bezüglich der Synthese osteogener Matrix den Gruppen A und C überlegen. Die quantitative Evaluation der Expression osteogener sowie chondrogener Markergene zeigten eine signifikant höhere Expression osteogener Marker in Gruppe B. Eine Matrixcalcifizierung der zuvor in vitro chondro-osteogen vordifferenzierten Zellpellets konnte im semi-in vivo Modell auf der Chorioallantoismembran des bebrüteten Hühnereis bei fehlendem osteogenen Stimulus demonstriert werden. V. Schlussfolgerung Ein sequentielles chondro-osteogenes Differenzierungspotential für humane mesenchymale Stammzellen konnte gezeigt werden. Ein chondrogenes Priming von osteogen weiterdifferenzierten MSC scheint in einem stabilen osteogenen Phänotyp zu resultieren. Es konnte ein matrixfreies dreidimensionales Zellkonstrukt mit osteogener Potenz erzeugt werden, das als matrixfreie Tissue Engineering Applikation zur Behandlung von Knochendefekten genutzt werden könnte. VI. Literatur 1 Arinzeh T. L., Peter S. J., Archambault M. P., van den Bos C., Gordon S., Kraus K., Smith A. Kadiyala S. (2003) Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect. J Bone Joint Surg Am 85-A: 1927-35. 2 Bruder S. P., Kraus K. H., Goldberg V. M. Kadiyala S. (1998) The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. 80: 985-96 3 Niemeyer P., Kasten P., Simank H. G., Fellenberg J., Seckinger A., Kreuz P. C., Mehlhorn A., Sudkamp N. P. Krause U. (2006) Transplantation of mesenchymal stromal cells on mineralized collagen leads to ectopic matrix synthesis in vivo independently from prior in vitro differentiation. Cytotherapy 8: 354-66 4 Mehlhorn A. T., Schmal H., Kaiser S., Lepski G., Finkenzeller G., Stark G. B. Sudkamp N. P. (2006) Mesenchymal stem cells maintain TGF-beta-mediated chondrogenic phenotype in alginate bead culture. Tissue Eng 12: 1393-403 5 Niemeyer P., Krause U., Fellenberg J., Kasten P., Seckinger A., Ho A. D. Simank H. G. (2004) Evaluation of Mineralized Collagen and alpha-Tricalcium Phosphate as Scaffolds for Tissue Engineering of Bone Using Human Mesenchymal Stem Cells. Cells Tissues Organs 177: 68-78 Abb. 2: Zellpellets der Gruppe B Obere Zeile: von Kossa Färbung zur Darstellung osteotypischen Calciums/Calciumsalzes Untere Zeile: Safranin-O-Färbung zur Darstellung chondraler Proteoglykane Linke Spalte: Zellpellets nach 14 Tagen chondrogener Induktion, LM 20x Mittlere Spalte: Zellpellets nach 14 Tagen chondrogener und 7 Tagen osteogener Stimulation, LM 10x Rechte Spalte: Zellpellets nach 14 Tagen chondrogener und 14 Tagen osteogener Stimulation, LM 10x