Microarrays – Prinzip Unprozessiertes Microarray: Probenzugabe: Belegung mit Molekülen (Spots ) Probenzugabe: Probenvorbereitung aus Blut, Gewebeproben, etc., Einwirkung der Probe Prozessiertes Microarray: Fluoreszierende Moleküle machen die Information sichtbar © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH

Microarrays – Aktivierung der Oberfläche Reaktive Gruppen (Epoxy- sowie Aldehyd-Gruppen) ermöglichen das kovalente Binden von Bio-molekülen: dadurch reproduzierbare Ergebnisse bei der Immobilisierung, kein Abwaschen der Sonden. Amino-Slides mit primären Aminogruppen auf der Oberfläche für nicht-kovalente Immobilisierung von Biomolekülen. © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH

Quantifoil-Produkteignung Microarrays – Quantifoil Produkte Quantifoil Slides – Anwendungsfelder Quantifoil-Produkteignung Oligo- nukleotide PCR- Produkte Proteine Peptide Zellen mit NH2-Link ohne Epoxy-Slides +++ ++ / Aldehyde-Slides - Amino-Slides +++ sehr gut geeignet, ++ gut geeignet, + geeignet, - nicht geeignet, / bisher nicht getestet © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH

ex situ Synthese -Spotten Mögliche Dispensierwerkzeuge: Ring-and-Pin Piezodüsen Spotting-Roboter Nadeln © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH

Spotten Einflussparameter beim Spotten: Art der Oberflächenaktivierung (Epoxy-, Aldehyd-, Amino-Gruppe etc., Herstellungsverfahren) Konzentration und Zusammensetzung des Spottingspuffers (pH-Wert, Ionenstärke, Art des Pufferions, Detergenzien, Viskosität, Dampfdruck) Benetzungsverhalten der Oberfläche (Hydrophobizität) Spotting-Technologie (kontaktfrei, mit Kontakt) Eintrocknungsverhalten der abgesetzten Tropfen (Spottingpuffer, Umgebungstemperatur, Luftfeuchte, Immobilisierungsschritte) Einfluss der Linkermodifikation ( z.B. mit bzw. ohne Aminolink) © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH

Markierungsmethoden Indirekte Markierung durch reverse Transkription cDNA-Synthese NH2 + Aminoallyl-dUTP, dGTP, dATP, dCTP RNA (total RNA, mRNA), Primer, Reverse Transkriptase + RNAse H NH2 + aminoreaktiver Fluoreszenzfarbstoff (z.B. N-hydroxysuccinimid-Fluoreszein) Hybridisierung © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH

Markierungsmethoden Direkte chemische Markierung der Nukleinsäure Beispiel: Reaktion eines fluoreszenzmarkierten Platin-Komplexes mit N7 von Guanin Pt Nukleinsäure (DNA) (modifiziert auch für das Markieren von Proteinen anwendbar) © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH

Microarrays – Expressionsanlyse mit DNA-Microarrays Kontrolle (gesundes Gewebe, Normalbedingung) Testprobe (krankes Gewebe, Stressbedingung etc. mRNA mRNA Amplifikation, Markierung Oligonukleotid, PCR-Produkt, cDNA (Sonde/probe) Probe/target Microarray Hybridisierung Detektion/Auswertung © 2002 Quantifoil Micro Tools GmbH