Projekttreffen Jena Teilprojekt 3 Friedrich-Schiller-Universität Jena Institut für Ernährungswissenschaften Lehrstuhl Ernährungsphysiologie.

Präsentation zum Thema: "Projekttreffen Jena Teilprojekt 3 Friedrich-Schiller-Universität Jena Institut für Ernährungswissenschaften Lehrstuhl Ernährungsphysiologie."—  Präsentation transkript:

1 Projekttreffen 2011 - Jena Teilprojekt 3 Friedrich-Schiller-Universität Jena Institut für Ernährungswissenschaften Lehrstuhl Ernährungsphysiologie

2 Auftrennung der Lipidklassen mittels DC und Densitometrie Quantitative Messung der Tonwerte pro Flächeneinheit Bestimmung der prozentualen Anteile der Lipidklassen einer Probe Alternative zum internen Standard der Gaschromatografie

3 Densitometrie - Methode 1. Auftragen von Standards und Proben 2. Auftrennung der Lipidklassen 3. Färbung/Fixierung

4 Densitometrie - Methode 3. Gefärbte HPTLC-Platte 4. Scanner 1:641:161:21:321:81:1 Standards D0 10µL D50 10µL D100 10µL D0 20µL D50 20µL D100 20µL Darmsäfte CE FAME TAG FFS Chol PL

5 Densitometrie - Ergebnisse KlasseBahn 7Bahn 8Bahn 9Bahn 10Bahn 11Bahn 12 PL14115.811957.66430.96152.65594.54265.5 Chol2286.73172.02070.02421.01485.12050.1 FFS25825.431248.625605.131347.423439.330185.6 TAG15524.820795.012588.515918.14409.36273.8 FAME5342.98511.77166.011307.76502.89747.1 CE12139.616238.311510.215955.611482.414591.2 KlassemnD0 10µLD0 20µLD50 10µLD50 20µLD100 10µLD100 20µL PL367.494372.4426.5120.645.604.843.33-0.29 Chol17387.491068.960.070.120.060.080.020.06 FFS846.818253.0220.7527.1620.4927.2717.9325.90 TAG1510.023151.708.1911.686.258.450.832.07 FAME5198.49928.920.851.461.202.001.071.70 CE4913.282301.812.002.841.872.781.872.50 Klassen in %D0 10µLD0 20µLD50 10µLD50 20µLD100 10µLD100 20µL Freies Cholesterin0.220.280.19 0.110.18 Freie Fettsäuren65.1262.7868.6067.2182.5280.38 Triacylglyceride25.7127.0120.9220.833.836.42 Fettsäuremethylester2.663.374.024.924.935.26 Cholesterolester6.286.566.276.858.607.76

6 Densitometrie - Ergebnisse 123456 Durchschnittliche Molare Masse der FS:281.62281.63281.56281.37281.44279.89 Molare Masse von Glycerol:92.10 Molare Masse von Wasser:18.02 Durchschnittliche Molare Masse des TAG:882.93 882.73882.18882.39877.73 Glycerinanteil [%]:10.089 10.09110.09710.09510.148 FFS [%]63.95 FS aus TAG [%]23.701 23.70023.69823.69923.685 FS aus FAME [%]2.86 FS aus CE [%]2.61 2.60 Summe:93.13 93.12 93.10 Faktor:0.931

7 Genexpression Frage:Hat eine CLA-Supplementation Einfluss auf die Expression bestimmter Kandidatengene? Welche Gene sind von Interesse? Wie wird die Genexpressionsanalyse realisiert? Was kann man aus den Daten ableiten?

8 Micro-Array - Layout 211212213214215216217218219220221222223224225 196 199200201202203204205206207208209210 181 184185186187188189190191192193 166 169170171172173174175176177178 151152153154155156157158159160161162163164165 136137138139140141142143144145146147148149150 121122123124125126127128129130131132133134135 106107108109110111112113114115116117118119120 919293949596979899100101102103104105 767778798081828384858687888990 616263646566676869707172737475 464748495051525354555657585960 31 343536373839404142 45 16 192021222324252627 30 123456789101112131415 Spot IDNAME 1 ACAA1_33 2ACAA2_34 3 ACACA_35 4ACACB_36 5 ACADL_37 6ACADM_38 7 ACADSB_89 8ACADS_39 9 ACADVL_90 10ACSL1_40 11 ACSL4_41 12ACSS1_42 13 ACSS2_43 14ACTB_10 15 ADIPOR1_86 16ADIPOR2_87 19 AGPAT1_91 20AGPAT2_92 21 AGPAT3_93 22AGPAT4_94 23 AGPAT5_95 24AGPAT6_96 25 CEBPA_44 26CEBPB_45 27 CEBPD_46 30CEBPE_47 31 CEBPG_48 34CEBPZ_49 35 CPT1A_50 36CPT1B_51 37 CPT2_11 38DCI_2 39 DGAT1_52 40DGAT2_53 Spot IDNAME 41 ECH1_12 42ECHS1_54 45 EHHADH_19 46ELOVL1_23 47 ELOVL2_24 48ELOVL3_25 49 ELOVL4_26 50ELOVL5_27 51 ELOVL6_28 52ELOVL7_29 53 FABP1_55 54FABP2_56 55 FABP3_57 56FABP4_58 57 FADS1_59 58FADS2_60 59 FASN_13 60FFAR2_61 61 FFAR3_62 62GAPDH_63 63 GPAM_15 64HADH_14 65 HP_1 66IL6_3 67 INSIG1_30 68INSIG2_31 69 LEPR_16 70LEP_4 71 LIPE_17 72LPIN1_64 73 LPIN2_65 74LPIN3_66 75 LPL_5 76MCAT_18 Spot IDNAME 77 MLXIPL_77 78MLX_6 79 NR1H2_67 80NR1H3_68 81 PLA2G2D1_82 82PLA2G2D3_83 83 PLA2G2D4_84 84PLA2G2D5_85 85 PLA2G4A_88 86PLCB1_69 87 PLCB3_70 88POR_7 89 PPARA_71 90PPARD_72 91 PPARG_73 92PTGS1_74 93 PTGS2_75 94SCAP_20 95 SCD5_21 96SCD_8 97 SLC25A20_32 98SLC27A6_78 99 SLC2A4_79 100SREBF1_80 101 SREBF2_81 102THRSP_76 103 TNF_9 104UCP1_22

9 Vorgehensweise 1.RNA-Extraktion aus Geweben (Leber & Euter) 2.cDNA-Synthese 3.Hybridisierung (Micro-Array) 4.Analyse und Auswertung

10 RNA-Extraktion Homogenisierung 3 min bei max Geschw. Überstand auf gDNA Eliminator Säule 30 s bei RT und 8000 x g 70%igen EtOH zugeben/mischen max. 700 µL Probe auf RNA-Säule 15 s bei RT und 8000 x g Waschen mit 700 µL RW1-Puffer 15 s bei RT und 8000 x g 2 x Waschen mit 500 µL RPE-Puffer 2 min bei RT und 8000 x g 20 µL RNase freies Wasser (70-80°C) direkt auf Membran 10 min bei RT stehen lassen 1 min bei RT und 8000 x g mit weiteren 10 µL wiederholen Konzentrationsbestimmung

11 cDNA-Synthese KomponenteEndkonzentration Gesamt-RNA1,5 µg Primer20-50 pmol Bidest KomponenteEndkonzentration 5-fach Expand RT-Puffer1-fach DTT (100 mM)10 mM PCR dNTPs (5 mM dACGTP, 2 mM dTTP) 120 µM dACGTP, 50 µM dTTP Expand RT (50 U/µL)75 U + 100 U Biotin-16-dUTP(1 mM)50 µM Denaturieren der RNA und des Primers (10 min bei 65°C) sofort auf Eis abkühlen 1 M NaOH 10 min bei 65°C inkubieren 1 M HCl zur Neutralisation Reinigung der cDNA 10 min bei RT 50 min bei 42°C Erneute Zugabe von Reverser Transkriptase 60 min bei 42°C

12 Micro-Array - Funktionsweise  Basis bildet ein Mikroreaktionsgefäss  Glasträger (3x3 mm) im Boden integriert  Glasträger ist mit 15x15 Spots gefertigt Biotinmarken Referenzpunkte

13 Micro-Array - Funktionsweise  nicht-radioaktive Markierung der cDNA mit Biotin  Hybridisierung der cDNA mit den Sequenzen auf dem Glasträger (1 h bei 55°C und 550 rpm)  Konjugation des Biotins mit Streptavidin/HRP (10 min bei 30°C und 550 rpm)

14 Micro-Array - Funktionsweise  Substrat TMB (Tetramethylbenzidin) wird durch HRP (horseradish peroxidase) umgesetzt  5 min bei RT  Bildung eines blau-grünen Präzipitats  Detektion innerhalb der nächsten 20 min  Analyse erfolgt über spezielle Software

15 Micro-Array – Erste Ergebnisse E620 E640E641E647 E669 Euter – K105

16 Euter – CLA105 Micro-Array – Erste Ergebnisse E617 E630E638E644 E653 E655

17 Micro-Array – Erste Ergebnisse (n=5) Euter – Kontrolle 105 vs. CLA 105