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Molekulargenetische AB0- Typisierung Dr. G. Heymann.

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Präsentation zum Thema: "Molekulargenetische AB0- Typisierung Dr. G. Heymann."—  Präsentation transkript:

1 Molekulargenetische AB0- Typisierung Dr. G. Heymann

2 Einsatzgebiete Serologische Bestimmung ist unmöglich: –Vortransfusion –KMT Serologie ergibt unklare Ergebnisse Pränataldiagnostik Familienstammbaum wissenschaftliche Fragestellungen

3 Bisherige Fragestellungen Antigenseite paßt nicht zur Serumseite –schwaches Antigen? Serumseite paßt nicht zur Antigenseite multiple Vortransfusion auffälliger Bed-side Test Neugeborenes / Mutter Chimärismus

4 Bisherige Fragestellungen II Von 157 ausgewerteten Untersuchungen –betrafen 57 (36%) AB0-System –im Vergleich: –Rhesus 80 (51%), HTLA 11 (7%), andere (MNS, K, Fy, Jk) 9 (6%) –Im AB0-System konnten 67% problemfrei aufgeklärt werden. –Weitere 16% ergaben bedingt ein Ergebnis.

5 Bisherige Fragestellungen III Ca. 25%

6 Generelle Probleme Nachweis eines Polymorphismus der AB0- Transferase ist nur indirekte Blutgruppen- bestimmung. Bestimmung einer Variante basiert allein auf dem Ausschluß von Unnormalem. Molekulargenetische Nomenklatur ist uneinheitlich und nicht mit Serologie vergleichbar.

7 AB0-Blutgruppen

8 N-Acetylgalaktosamin an verzweigten Ketten

9 Sequenzen Exon 6 Exon 7 Spezifisch für 0Spezifisch für B 0o2 0o3 A104 A204 Ax02 0o8 0o9 A102 A103 Ael02 0o3 A204 A206 0o9 A A204 A206 Spezifisch für B 0o8 A302 Aw02 Aw03

10 Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

11 Prinzip der PCR-SSP 5´ 3´ 5´ Primerannealing bei °C Antisenseprimer Senseprimer

12 Prinzip der PCR-SSP 5´ 3´ 5´ Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet.

13 Auflösungsvermögen Die PCR-SSP erkennt (nur!?) bekannte Varianten Watanabe8 Mixe A/01,B/01,01,01,02,B,A2,Alle(A2) Kommerziell8 Mixe 01, n01, 02, n02, B, nB, A2, nA2 –InnoTrain, BAG Eigene PCR48 Mixe Hannover96 Mixe Ausschluß um so besser möglich, je mehr Varianten erkannt werden.

14 Besondere Befunde Pruß A, Heymann GA et al., Acute intravascular hemolysis after transfusion of a chimeric RBC unit. Transfusion 2003; 43:

15 Besondere Befunde Spenderin wurde initial als B bestimmt. Beim Bed-side Test aus Konserve fiel ein schwaches A auf. 721

16 Prinzip der Sequenzierung 5´ 3´ 5´ Primerannealing bei °C nach Denaturierung Sequenzierprimer

17 Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis Cyclen beendet. Es entstehen verschieden lange Ketten, die aufgetrennt werden können. Prinzip der Sequenzierung 5´ 3´ Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C bis Kettenabbruch

18 Nondeletionale 0 Allele A. Seltsam, Arbeitsgruppentagung, Hannover 2004 Es gibt AB0-Transferase, die keine Deletion an 261 zeigen, jedoch eine große Anzahl von Mutationen aufweisen. Diese 0-Allele zeigen kaum Aktivität. Es kommt jedoch, zumindest bei 0o3, zu einer nachweisbaren Menge von A auf den Erys. Dies reicht aus, um Isoagglutinine zu supprimieren. Bisher hier 4 Fälle mit antigenseitig 0, serumseitig A.

19 Nomenklatur Die Allele wurde v.a. nach der serologischen Reaktivität der Erstbeschreibung benannt. Diese deckt sich fast nie mit der Reaktivität der gleichen Allele bei späteren Patienten. Beispiele für Benennung: –0o1: auch 01, 0a –0o6: auch 0v1, 0tlse1 –A201: auch A105, A2, Aw-1 –cisAB01: auch C101 Von 3 Ael Verdachtsfällen waren bisher 2 Ax01 und 1 A104, keines Ael01(A109, Ael1) oder Ael02(A110, Ael2).

20 Besonderheit: 1 Transferase = 2 Antigene Es gibt Allele, die eine Konjugierung mit Gal und N-Ac-Gal gleichermaßen vermitteln. Phänomen des Cis-AB

21 Kosten Pro Primer0,02 Euro 60 versch. Primer=1,20 Euro –Für Platin Taq3,56 Euro –Für PCR-Puffer1,- Euro –Gel, Photo, Puffer1,50 Euro –DNA-Isolierung3,- Euro kommerziell (BAG)250,-Euro / 10 Tests pro TestIn Houseca. 10,- Euro kommerziellca. 30,- Euro (weniger Verbrauchsmaterial) Dauer: min. ca. 3 h

22 Fazit Die Fragestellung entscheidet essentiell über den Aufwand, der betrieben werden muß. Die Ursache für serologisch unklare AB0- Bestimmungen ist nur in seltenen Fällen eine Mutation. Es ist meist keine direkte Aussage zur vermutlichen serologischen Reaktivität möglich.

23 Literatur zum Nachlesen Zur PCR: –Watanabe et al. Human Genetics 1997;99;34-37 –Yip. Blood 2000;95;1487ff –Gassner et al. Blood 1996; 88; Zu einzelnen Allelen: –Yamamoto et al. Vox sanguinis 1993; 64; und und –Yamamoto et al. Vox sanguinis 1995; 69; 1-7 –Olsson et al. Blood 2001; 98; 1585ff Im Internet: –Blood Group Antigene Gene Mutation Database:


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