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Mikrobiell-serologische Untersuchungen Immunchemische Verfahren zum Nachweis von Antigen bzw. Antikörper und Stufenschema der Toxoplasmose Diagnostik Prof.

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Präsentation zum Thema: "Mikrobiell-serologische Untersuchungen Immunchemische Verfahren zum Nachweis von Antigen bzw. Antikörper und Stufenschema der Toxoplasmose Diagnostik Prof."—  Präsentation transkript:

1 Mikrobiell-serologische Untersuchungen Immunchemische Verfahren zum Nachweis von Antigen bzw. Antikörper und Stufenschema der Toxoplasmose Diagnostik Prof. R. R. Reinert

2 Ziel Wichtigsten serologischen Testsysteme kennen Bedeutung der Serologie in der Storch Diagnostik Vorlesung bitte von herunterladen

3 Indikationen zur Serologischen Untersuchung Der direkte Erregernachweis ist in der Regel vorzuziehen ! Aber einige Erreger sind: –Nur schwer anzuzüchten –Die Anzucht dauert zu lange Beispiele –Viren –Toxoplasmose –Lues

4 Direkter Nachweis von Antigenen oder Antikörpern in der mikrobiellen Serologie Direkte Agglutination (Gruber-Widal-Reaktion) Immunpräzipitation (Immundiffusionsverfahren) Indirekter Nachweis von Antigenen oder Antikörpern in der mikrobiellen Serologie Latexagglutination Indirekte passive Hämagglutination (IHA, indirekte Hämagglutination) Komplement-Bindungsreaktion (KBR) Assays mit Markierung eines Reaktionspartners Immunfluoreszenztest (IFT) Immunoassays (z.B. ELISA) Mikrobiell-serologische Untersuchungsmethoden

5 Erreger prä- und perinataler Infektionen I (S)ToRCH: (Syphilis) T oxoplasma gondii other infectious microorganisms Rötelnvirus C ytomegalievirus H erpes-simplex-Virus

6 Erreger prä- und perinataler Infektionen II Viren Varizella-Zoster-Virus (VZV) Parvovirus B19 Masernvirus Hepatitisviren (HBV, HCV, HGV) HIV 1 / 2 Papillomavirus Bakterien Listeria monocytogenes Streptococcus agalactiae Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma hominis / Ureaplasma urealyticum

7 Syphilis –auch Lues –harter Schanker –Franzosenkrankheit Ansteckende Geschlechtskrankheit, die von Treponema pallidum verursacht wird Syphilis wird bei sexuellen Handlungen durch Schleimhautkontakt von Mensch zu Mensch übertragen Während der Schwangerschaft und bei der Geburt kann eine erkrankte Mutter ihr Kind infizieren (Syphilis connata)

8 Lues connata Die Treponemen sind ca. ab der 20. Schwangerschaftswoche plazentagängig Als Folge hiervon kann es entweder zur Fehl- oder Frühgeburt kommen, oder aber das Kind kommt mit einer angeborenen Syphilis, der Lues connata, zur Welt. Wird diese vor dem 2. Lebensjahr symptomatisch, so spricht man von der Lues connata praecox (übers.: vorzeitige angeborene Lues). –makulopapulöses (übers.: fleckig; an den Haaransätzen kleine Knötchen) Exanthem – plattenförmige Hautveränderungen – Hepatosplenomegalie –blutiger Schnupfen. Bei Symptomen nach dem 2. Lebensjahr spricht man dagegen von der Lues connata tarda –Hutchinson-Trias –Hornhautentzündung (Keratitis) –Innenohrschwerhörigkeit –Tonnenförmige Schneidezähne –Zusätzlich kann eine sog. Sattelnase auftreten.

9 Syphilis

10 Lues connata

11 Toxoplasmose

12 Toxoplasmose in der Schwangerschaft

13 Frauen, die einmal eine Toxoplasmose-Infektion hatten, haben Antikörper im Blut und sind normalerweise gegen eine Ansteckung immun - es besteht kaum Gefahr für den Fötus Eine erstmalige Erkrankung der Mutter im ersten oder zweiten Drittel einer Schwangerschaft kann zu erheblichen Schädigungen des ungeborenen Kindes führen. Die Wahrscheinlichkeit der kindlichen Infektion beträgt im –1. Trimenon 15 % –2. Trimenon 45 % –3. Trimenon %

14 Toxoplasmose in der Schwangerschaft Im ersten Trimenon entwickeln 70 % der infizierten Kinder eine konnatale Toxoplasmose, die meist zur Fehlgeburt führt. Im zweiten und dritten Trimenon entwickeln 30 bzw. 10 % eine konnatale Toxoplasmose Die infizierten Kinder können –epileptische Anfälle –kognitive Einschränkungen –Schäden an der Leber – Lunge –Gehirn –Augen –Herzmuskel –Hirnhaut

15 Toxoplasmose in der Schwangerschaft Die typische Trias bestehend aus –Hydrozephalus –intrazerebraler Verkalkung –Chorioretinitis Wird jedoch nur bei 2 % der Betroffenen ausgeprägt.

16 Virusinfektionen in der Schwangerschaft Klinik nach Infektionszeitpunkt VirusEmbryopathieFetopathieperinatale Infektion R ö teln Abort, Gregg-Syndrom Fr ü hgeburt, Hepatosplenomegalie, Encephalitis nicht bekannt CytomegalieAbort, Hepatosplenomegalie, Encephalitis Fr ü hgeburt, Hepatosplenomegalie, Encephalitis Cytomegalie Parvovirus B19 AbortHydrops fetalisnicht bekannt MasernHerzfehler* Fr ü hgeburt Masern MumpsAbort*nicht bekannt HSV 1 / 2Mikrocephalus* Fr ü hgeburt / Fruchttod generalisierte HSV- Infektion, Encephalitis VZV Augenmi ß bildungen* nicht bekanntgeneralisierte Varizellen, Encephalitis PoliomyelitisAbort*FruchttodPoliomyelitis * in Einzelfällen

17 Röteln Erreger ist das Rötelnvirus. Es gehört zur Familie der Togaviridae Behülltes Einzelstrang[+]-RNA Virus Man bezeichnet den Erreger auch als Rubellavirus.

18 Röteln Inkubationszeit: 14 bis 21 Tagen Es bilden sich zunächst im Gesicht gerötete, einzelstehende Hauteffloreszenzen –Stamm –Extremitäten Erhöhte Temperatur bis 39 Grad Celsius –Gliederschmerzen –Arthritis –Lymphknotenschwellung am Hinterkopf –Nacken –HSM

19 Röteln

20 Röteln in der Schwangerschaft In den ersten sechs Wochen der Schwangerschaft führt eine Rötelninfektion in 65 % der Fälle zur Erkrankung des Fetus Mit fortschreitender Schwangerschaft sinkt das Risiko der Erkrankung Die Folge einer Infektion des Fetus sind regelmäßig Fehlbildungen –Innenohrschwerhörigkeit –Herzfehler, –Gefäßfehlbildungen (offener Ductus Botalli, Septumdefekte und Fallot'sche Tetralogie) –Spina bifida aperta –Enzephalomeningitis Daher gehört die Untersuchung auf Röteln zur Mutterschaftsvorsorge

21 Testverfahren In der Vorlesung –Elisa –HHT –KBR –IFT Im Praktikum –Direkte Agglutination –Immundiffusion

22 Elisa Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA) bzw. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunologisches Nachweisverfahren Radioimmunoassay (RIA): Radioaktivitätsmessung Enzymatische Farbreaktion Nachweis von: –Proteine –Viren –Niedermolekulare Verbindungen Hormone Toxine Pestizide

23 ELISA (Sandwich) Spezifischer humaner Antikörper Mikrotiterkavität mit Antigen beschichtet Mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Human- Antikörper AP Chromogenes Substrat Chromogener Farbstoff 1. Inkubation 2. Inkubation 3. Inkubation

24 Elisa

25 Sandwich Elisa (Verstärkungssysteme)

26 Elisa Systeme

27 Elisa-Systeme

28 Hämagglutination

29 Hämagglutinationshemmtest (HHT) Bestimmte Bakterien und Viren bilden Hämagglutinine ( = Stoffe die Ery´s agglutinieren können). Befinden sich im Untersuchungsmaterial spezifische Antikörper gegen ein Hämagglutinin, so kommt es nach AG Zugabe zu einer AG - AK - Reaktion. Diese wird dadurch sichtbar, daß danach zugegebene Erythrozyten nicht mehr agglutiniert werden. Die Reaktion wird gehemmt : Hämagglutinin - Hemmung )

30 Komplementbindungsreaktion Allgemeines: Indirektes Verfahren zum Antikörpernachweis, technisch aufwendig Wegen der Vielfalt der Reaktionsteilnehmer relativ störanfällig IgG- und IgM-Nachweis (Differenzierung nicht möglich) Hohe Spezifität und (im Vergleich zu anderen Verfahren, z.B. EIA oder IFT) geringe Sensitivität

31 Komplementbindungsreaktion Diagnostische Bedeutung: Vorwiegende Anwendung zur bakteriellen und parasitären Infektionsdiagnostik V.a. Erkennung von Infektionen im Frühstadium (mit hohen Titern erregerspezifischer IgM-Antikörper) Heilungsverlauf (z.B. Cardiolipin-KBR unter Luestherapie)

32 Komplementbindungsreaktion Testvoraussetzungen: Steriles Serum (mögliche antikomplementäre Wirkung durch bakt. Verunreinigung !) Vor Testbeginn: Hitze-Inaktivierung des Patientenserums zur Eliminierung patienteneigenen Komplements (30 min. 56°C) Strikte Einhaltung bestimmter quantitativer Beziehungen der einzelnen Reaktionspartner zueinander

33 Komplementbindungsreaktion

34

35 Merke: wurde das Komplement verbraucht (AK vorhanden) tritt keine Zelllyse ein. Es entsteht ein Knopf.

36 KBR

37 Toxoplasmose- Serodiagnostik Stufendiagnostik iIFT (Indirekte Immunfluoreszenz) IgG- oder IgM-Nachweis ELISA (Enzyme linked Immuno-Sorbent Assay) IgG- oder IgM-Nachweis ISAGA (Immuno-Sorbent-Agglutination Assay) IgM-Nachweis Hochspezifisch Aviditätstest IgG-Reifebestimmung

38 Immunfluoreszenszenz

39 Nachweis von Toxoplasma gondii Antikörpern im indirekten Immunfluoreszentest (iIFT)

40 Toxo-ISAGA (Immunosorbent Agglutination Assay) 2-stufige Reaktion: 1. Humane IgM-Antikörper im Serum binden an die monoklonalen anti-human Antikörper in den Kavitäten 2. Spezifisches Toxoplasma IgM wird durch Zugabe von mit Formalin behandelten Toxoplasmen nachgewiesen Negativ: Sedimentation der Toxoplasmen Positiv: Schleierbildung durch Agglutination der Toxoplasmen

41 Meßung der Avidität Die Aviditätsbestimmung beruht auf einer Herabsetzung der Bindungsstärke der Antigen-Antikörper-Bindung durch ein mildes Protein-denaturierendes Reagenz, meist Harnstoff. Dabei werden nur die Antigen-Antikörper-Komplexe niedrig-avider Antikörper dissoziiert (getrennt), Antigen-Antikörper-Komplexe hoch-avider Antikörper bleiben unbeeinflußt. Extinktion mit Harnstoff % Aviditätsindex = x 100 Extinktion ohne Harnstoff

42 IgG Avidität ToxoplasmaInterpretation Index < 0,200IgG mit niedriger Avidität 0,200 < Index 0,300Mittlere Avidität Index > 0,300IgG mit hoher Avidität (frische Infektion älter als 4 Monate)

43 Ziel erreicht? Wichtigsten serologischen Testsysteme kennen Bedeutung der Serologie in der Storch Diagnostik

44 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit Und…… Viel Spaß im Praktikum


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