Durchflusszytometrie

Präsentation zum Thema: "Durchflusszytometrie"—  Präsentation transkript:

1 Durchflusszytometrie
Apoptoseanalyse Jörn Schulze Strahlenbiologie, Klinik für Strahlentherapie, Campus Mitte

2 Inhalt Durchflusszytometer Apoptose Analyse der Apoptose

3 Durchflusszytometer - Einleitung -
optisches Messsystem Streulicht- und Fluoreszenzsignale von Partikeln bzw. Zellen gleichzeitige Messung von physikalischen und biochemischen Parametern: Größe Oberfläche Granularität markierte Proteine

4 Durchflusszytometer - Geschichte -
50er Jahre: Hämatologiezählgeräte mittels elektrischer Widerstandsmessung 60er Jahre: Durchlusszytometer zur Messung von Tumorzellen, Lymphozyten und Bakterien mit Hilfe von Protein- und DNA-Farbstoffen und fluoreszenzmarkierten Antikörpern

5 Durchflusszytometer - Lichtstreuung -
Streuung eines Lichtstrahles beim Auftreffen auf eine Zelle beeinflussende Zelleigenschaften: Querschnittsfläche Refraktionsindex Membranstruktur intrazelluläre Bestandteile

6 Durchflusszytometer - Lichtstreuung -
Vorwärtsstreulicht FSC* (axial) Seitwärtsstreulicht SSC** (orthogonal) Intensität FSC >> SSC Sensitivität Querschnittsfläche Refraktionsindex Information Zellgröße Granularität Membranfaltung Form * forward angle light scatter ** side scatter

7 Durchflusszytometer - Komponenten -
Flüssigkeitssystem optisches System Signalverarbeitunssystem

8 Durchflusszytometer - Flüssigkeitssystem -
Laserstrahl Messküvette Trägerflüssigkeit Zellsuspension hydrodynamische Fokussierung Der Probenstrom wird durch eine konische, auf das Lumen der Küvette angepasste Kapillare stark beschleunigt (ca. 7 m/s). Damit wird eine Einzelzellsuspension, ähnlich einer Perlenkette gewährleistet.

9 Durchflusszytometer - optisches System -
Laserstrahl Quarzglasküvette Blockerstreifen Sammellinse Teilerspiegel Photodiode Lichtfilter verschiedene Photomultiplier

10 Durchflusszytometer - optisches System -
Anregungsteil für Lichtstrahlformung prismatische Strahlexpander und Linsen Lichtstrahl mit horizontal-elliptischen Durchmesser (ca. 20 x 60 μm) für hohe räumliche Auflösung und ausreichender Signalintensität

11 Durchflusszytometer - optisches System -
Detektionsteil Vorwärtsstreulicht Seitwärtsstreulicht Trennung von Seitwärtsstreu- und Fluoreszenzlicht Zerlegung der Fluoreszenz in verschiedene Farbbereiche Photoröhren für Seitwärtsstreu- und Fluoreszenzlicht lichtaktive Photodioden für Vorwärtsstreulicht Umwandlung des Lichtsignals in ein elektrisches Signal

12 Durchflusszytometer - Signalverarbeitungssystem -
Schwellenwert Differenzierung von Zell- und Störsignalen mittels elektronischer Schwelle, bezogen auf einen bestimmten Auslöseparameter (Trigger, z.B. FSC) Digitalisierung Analog-Digital-Wandler (ADC) registrierte Signalintensität [V] → Kanalzahl (256 bzw Kanäle)

13 Darstellung der Messergebnisse - einparametrig -
Histogramm bzw. Häufigkeitsverteilung digitale Messsignale → Kanalwerte von 0 bis 255 bzw. 1023 Ordinate: Anzahl der Zellen Abszisse: Kanäle lineare und logarithmische Darstellung

14 Darstellung der Messergebnisse - einparametrig -

15 Apoptose - Definition -
apo…: <griech> ab, weg, los ptosis: <griech> Senkung prgrammierter Zelltod („cell suicide“) aktiver, energieabhängiger Prozess ohne entzündliche Reaktion (Abgrenzung zur Nekrose)

16 Apoptose - Definition -
physiologisch: Embryogenese Metamorphose normale Zellerneuerung im Gewebe Entwicklung des Immunsystems terminale Differenzierung myeloischer Zellen

17 Apoptose - Definition -
pathologisch: ionisierende Strahlung zytotoxische Chemikalien Entzug spezifischer Wachstumsfaktoren (IL-2, IL-3, Serum, Steroidhormone) zytotoxische T-Zellen natürliche Killerzellen

18 Apoptose - Definition -
Der programmierte Zelltod ist in wachsenden und regressiven Tumoren nachweisbar. Er beeinflusst die Expansion der Tumor-Zell-Population über das Gleichgewicht von Zell-Gewinn und Zell-Verlust. Die Apotose ist die Art des Tumor-Zelltodes nach zytotoxischer Therapie.

19 Apoptose - Morphologie -
Phase I Abnahme des Zellvolumens Auflösen des Zellverbundes Verlust von Membranstrukturen (Mikrovilli, Pseudopodien) Kondensierung des Zytoplasmas Verdichtung zytoplasmatischer Organellen Auflösung des Nukleoli Kondensation des Chromatins Bildung von Vesikel, Verschmelzung mit der Zellmembran unveränderte Ribosomen und Mitochondrien keine erhöhte Permeabilität der Membran

20 Apoptose - Morphologie -
Phase II verstärkte Bläschenbildung auf der Zelloberfläche Zeiose - Lappung der Zelle Karyorrhexis - Fragmentierung des Nukleoli Apoptosekörper: membranumhüllte Kernfragmente mit Zytoplasma und Organellen einsetzende Phagozytose

21 Apoptose - Morphologie -
Phase III fortschreitende Degenerierung der restlichen Kern- und Zytoplasmastrukturen Permeabilität der Membran, mögliche Vitalfärbung

22 Apoptose - Morphologie -

23 Apoptose - Differenzierung von der Nekrose -

24 Analyse der Apoptose Möglichkeiten der Charakterisierung der Apoptose anhand der DNA-Schädigung und Membranveränderung

25 Analyse der Apoptose - Membran -
Cytoskelett bestehend aus Mikrofilamenten Actin-Filamente Formgebung (Mikrovilli) Kontakt (Pseudopodien) Beweglichkeit wandernder Zellen (Zusammenwirkung mit Myosin)

26 Analyse der Apoptose - Membran -
Actin F-Actin (filamentäres) G-Actin (globuläres) Polymerisation, ATP G-Actin F-Actin Depolymerisation, ADP Calcium Magnesium Proteine

27 Analyse der Apoptose - Membranveränderung -
Im Prozess der Apoptose kommt es zu einer Reduzierung der Pseudopodien und Mikrovilli und damit zu einer Abnahme des F-Actins.

28 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Phalloidin-Fluorescein-Konjugat Phalloidin: Grüner Knollenblätterpilz (Amanita phalloides) Hepatotoxizität: Blockierung der m-RNA-Synthese durch Komplexbindung mit der RNA-Polymerase im Zellkern irreversible Bindung an F-Actin und Hemmung der Depolymerisation keine Enzym- und Proteinsynthese in der Leber LD50 (Maus)=2 mg/kg KG

29 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Phalloidin

30 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Phalloidin-Fluorescein-Konjugat Fluorescein: Fluorochrom FITC (Fluorescein-Isothiocyanat): Farbstoff für sekundäre Fluoreszenz (Substratbindung über Haupt- und Nebenvalenzen) grüne Fluoreszenz 495 nm Extinktion 519 nm Emission

31 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Fluorescein stabile Kristallform (li.) und amorphie Verbindung (re.)

32 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 72 h nach Einsaat 0 Gy 2% FITC(-) 20 Gy 9% FITC(-)

33 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) h nach Einsaat 0 Gy 4% FITC(-) 20 Gy 36% FITC(-)

34 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) h nach Einsaat, 0 Gy

35 Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) h nach Einsaat, 20 Gy F-Actin-Verlust DNA-Verlust Polyploidie unregelmäßige Zellform

36 Analyse der Apoptose - Hinweise zur Methodik -
Die Durchführung der Methodik ist abhängig von der Zellart. Es müssen, i. b. bezüglich der Fixierung, eigene Erfahrungen gesammelt werden. Toxizität von Phalloidin FITC-PI-Beeinflussung Korrelation der Messergebnisse mittels Vitalfärbung Hoechst 33342

37 Analyse der Apoptose - Vitalfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) h nach Einsaat, 0 Gy

38 Analyse der Apoptose - Vitalfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) h nach Einsaat, 20 Gy