Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen Presented by Stefan Nickels Proseminar: Theoretical.

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen Presented by Stefan Nickels Proseminar: Theoretical."—  Präsentation transkript:

1 Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen Presented by Stefan Nickels Proseminar: Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions SS04

2 2 Übersicht Einführung Einführung 3 Arten von experimentellen Methoden 3 Arten von experimentellen Methoden Physikalische Methoden Physikalische Methoden Library basierte Methoden Library basierte Methoden Genetische Methoden Genetische Methoden 3 ausgewählte experimentelle Methoden 3 ausgewählte experimentelle Methoden FRET FRET NMR chemical shifts NMR chemical shifts NMR-based protein docking NMR-based protein docking Referenzen Referenzen Diskussion Diskussion

3 3 Was will man bestimmen? Auffinden von Proteinen, welche mit anderen wechselwirken Auffinden von Proteinen, welche mit anderen wechselwirken durch meist transiente aber auch persistente Bindung durch meist transiente aber auch persistente Bindung Bindungskonstante K i Bindungskonstante K i Thermodynamische Gleichgewichtsgröße Thermodynamische Gleichgewichtsgröße Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein gebunden Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein gebunden Je kleiner K i desto stärker Protein-Ligand Bindung Je kleiner K i desto stärker Protein-Ligand Bindung Freie Bindungsenthalpie G Freie Bindungsenthalpie G

4 4 Physikalische Methoden I Methodik Methodik Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von physiko- chemischen Eigenschaften der Wechselwirkungspartner Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von physiko- chemischen Eigenschaften der Wechselwirkungspartner Beispiele Beispiele Protein Affinity Chromatography Protein Affinity Chromatography Affinity Blotting Affinity Blotting Imunnoprecipitation Imunnoprecipitation Cross-Linking Cross-Linking

5 5 Physikalische Methoden II Affinitätschromatographie Affinitätschromatographie Um bindende Liganden zu finden Um bindende Liganden zu finden Immobilisierung des Proteins in der Säule auf einer Matrix Immobilisierung des Proteins in der Säule auf einer Matrix z.B. mittels GST Fusionsproteine z.B. mittels GST Fusionsproteine Proteine werden mit Gluthation S-Transferase markiert Proteine werden mit Gluthation S-Transferase markiert Dieses bindet an Gluthation- Agarose-Matrix Dieses bindet an Gluthation- Agarose-Matrix Zugabe des Ligandengemischs Zugabe des Ligandengemischs Bindende werden zurückgehalten, nicht bindende fließen durch Bindende werden zurückgehalten, nicht bindende fließen durch Komplexe können ausgewaschen werden Komplexe können ausgewaschen werden

6 6 Library basierte Methoden I Methodik Methodik Suche nach Bindungspartnern für gewisses Protein in Gen-Expressions-Bibliotheken Suche nach Bindungspartnern für gewisses Protein in Gen-Expressions-Bibliotheken Vorteile Vorteile Schnelles Screening einer große Menge von möglichen Liganden Schnelles Screening einer große Menge von möglichen Liganden Gensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbar Gensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbar Nachteil Nachteil Müssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werden Müssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werden Beispiele Beispiele Protein Probing Protein Probing Phage Display Phage Display Two-Hybrid Sytem Two-Hybrid Sytem

7 7 Library basierte Methoden II Two Hybrid System Two Hybrid System Modularer Aufbau von Transkriptionsfaktoren Modularer Aufbau von Transkriptionsfaktoren DNA-binding domain DNA-binding domain Activation domain Activation domain Nicht kovalente WW hinreichend für Funktion Nicht kovalente WW hinreichend für Funktion Erstellen von sog. Hybriden Erstellen von sog. Hybriden Protein X + DNA-binding domain Protein X + DNA-binding domain Protein Y + Activation domain Protein Y + Activation domain Wechselwirkung von X und Y Wechselwirkung von X und Y Domänen bilden funktionellen Aktivator für Reportergen => Expression Domänen bilden funktionellen Aktivator für Reportergen => Expression Screening von Activator domain markierten Transkripten einer cDNA-Library Screening von Activator domain markierten Transkripten einer cDNA-Library

8 8 Genetische Methoden I Methodik Methodik Nicht WW zwischen Proteinen werden bestimmt Nicht WW zwischen Proteinen werden bestimmt Sondern WW zwischen Genen werden betrachtet Sondern WW zwischen Genen werden betrachtet In vielen Fällen interagieren dann auch die Genprodukte In vielen Fällen interagieren dann auch die Genprodukte Oder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WW zu bestätigen Oder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WW zu bestätigen Beispiele Beispiele Extragenic Suppressors Extragenic Suppressors Synthetic Lethal Effects Synthetic Lethal Effects Overproduction Phenotypes Overproduction Phenotypes Unlinked Noncomplementation Unlinked Noncomplementation

9 9 Genetische Methoden II Extragenic Suppressors Extragenic Suppressors Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen hervorgerufene phenotypische Defekte aus Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen hervorgerufene phenotypische Defekte aus Beobachtung: Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Genprodukten der mutierten Gene wechselwirken Beobachtung: Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Genprodukten der mutierten Gene wechselwirken Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden Genprodukten durch z.B.: Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden Genprodukten durch z.B.: Kontrolle der Zellzyklen Kontrolle der Zellzyklen

10 10 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy I Zielsetzung Zielsetzung Beobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 Å Beobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 Å Betrachtung von Proteinen in Zellen in vivo Betrachtung von Proteinen in Zellen in vivo Proteine müssen mit Flurophoren gelabelt werden Proteine müssen mit Flurophoren gelabelt werden FRET FRET molecular ruler molecular ruler Bestimmung von Distanzen zwischen Molekülen Bestimmung von Distanzen zwischen Molekülen Viele verschiedene FRET-Methoden Viele verschiedene FRET-Methoden Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen im lichtmikroskopisch detektierbaren Bereich Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen im lichtmikroskopisch detektierbaren Bereich Detektion Normalerweise spektroskopisch Detektion Normalerweise spektroskopisch Hier lichtmikroskopisch Hier lichtmikroskopisch

11 11 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy II Funktionsprinzip Funktionsprinzip Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei bestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzen Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei bestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzen Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter Wellenlänge angeregt, so fluoresziert er Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter Wellenlänge angeregt, so fluoresziert er In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor, überträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptor In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor, überträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptor Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching) Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching) Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert werden Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert werden

12 12 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy III Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Distanz r der beiden Fluorophore Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Distanz r der beiden Fluorophore R 0 ist der sog. Förster-Radius R 0 ist der sog. Förster-Radius spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 Å spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 Å Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und Akzeptoranregungsspektrum Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und Akzeptoranregungsspektrum kein FRET bei Abständen > 2R 0 kein FRET bei Abständen > 2R 0 Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Donor- Emissions-Löschung Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Donor- Emissions-Löschung I DA = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors I DA = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors I DA = Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von photogebleichtem A. I DA = Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von photogebleichtem A.

13 13 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IV Experiment Experiment Untersuchung von WW zwischen Proteinen in der Plasmamembran Untersuchung von WW zwischen Proteinen in der Plasmamembran Fluorophor-Paar Fluorophor-Paar Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-Markierung Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-Markierung Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5-Nucleotidase aus der Leber von Ratten Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5-Nucleotidase aus der Leber von Ratten Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 markierten IgG-AntiKörpern Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 markierten IgG-AntiKörpern R 0 = 53 Å Donor Cy3 Akzeptor Cy5 Absorptionsmaximum 550 nm 650 nm Emissionsmaximum 570 nm 670 nm

14 14 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy V Aufnahme von 4 Bildern Aufnahme von 4 Bildern Cy3-Emission vor dem Bleichen Cy3-Emission vor dem Bleichen Auftreten des FRET Auftreten des FRET Wenig Donor Fluoreszenz Wenig Donor Fluoreszenz Cy5-Emission vor dem Bleichen Cy5-Emission vor dem Bleichen Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung mit Cy3 stattgefunden hat Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung mit Cy3 stattgefunden hat Cy3-Emission nach dem Bleichen Cy3-Emission nach dem Bleichen Kein FRET mehr Kein FRET mehr Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile) Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile) Cy5-Emission nach dem Bleichen Cy5-Emission nach dem Bleichen Keine Emission wegen vollständiger Ausbleichung Keine Emission wegen vollständiger Ausbleichung Datenanalyse Datenanalyse Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen: Berechnung eines Transfer-Effizienz-Bildes Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen: Berechnung eines Transfer-Effizienz-Bildes a= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwerte a= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwerte

15 15 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VI Auswertung Auswertung Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen 0 und 40% Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen 0 und 40% lassen hier nicht auf spezifische WW zwischen den Nucleotidasen schliessen lassen hier nicht auf spezifische WW zwischen den Nucleotidasen schliessen Effizienz hängt ab von der Oberflächendichte der Proteine in der Membran (Zufällige Nähe) Effizienz hängt ab von der Oberflächendichte der Proteine in der Membran (Zufällige Nähe) Fazit Fazit Transfer Effizienz reflektiert nicht unbedingt eine spezifische WW Transfer Effizienz reflektiert nicht unbedingt eine spezifische WW E abhängig von vielen Parametern: E abhängig von vielen Parametern: Größe des gelabelten Proteins Größe des gelabelten Proteins Sättigung des Antigens mit Antikörper Sättigung des Antigens mit Antikörper Orientierung der Fluorophore Orientierung der Fluorophore Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden werden Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden werden Verhältnis von Donor- zu Akzeptor-Markierung Verhältnis von Donor- zu Akzeptor-Markierung Gesamtkonzentration von markierten Molekülen Gesamtkonzentration von markierten Molekülen

16 16 NMR chemical shift mapping I Zielsetzung Zielsetzung Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen Proteinen mittels zweidimensionaler ( 1 H, 15 N)-HSQC-NMR-Spektroskopie Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen Proteinen mittels zweidimensionaler ( 1 H, 15 N)-HSQC-NMR-Spektroskopie Grundlagen der H-NMR Spektroskopie Grundlagen der H-NMR Spektroskopie Im Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von Protonenkernen Im Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von Protonenkernen Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel zum Magnetfeld Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel zum Magnetfeld Hierbei Resonanzphänomen: Absorption von Energie => NMR-Signal Hierbei Resonanzphänomen: Absorption von Energie => NMR-Signal Identifizierung aller Protonen in einem Molekül oder ein Komplex aus Molekülen Identifizierung aller Protonen in einem Molekül oder ein Komplex aus Molekülen

17 17 NMR chemical shift mapping II Die chemische Verschiebung Die chemische Verschiebung Abschirmung Abschirmung Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Magnetfeld => Abschirmungseffekt Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Magnetfeld => Abschirmungseffekt Höhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehen Höhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehen Signal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetisch Signal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetisch Entschirmung Entschirmung z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N) diese ziehen die Elektronen zu sich z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N) diese ziehen die Elektronen zu sich Niedrigere Feldstärke benötigt Niedrigere Feldstärke benötigt Signal im höheren Frequenzbereich => paramagnetisch Signal im höheren Frequenzbereich => paramagnetisch Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan) Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan) Alle Protonen in TMS gleiche chem. Umgebung => nur ein Signal Alle Protonen in TMS gleiche chem. Umgebung => nur ein Signal Alle Protonen maximal abgeschirmt Alle Protonen maximal abgeschirmt

18 18 NMR chemical shift mapping III Die J-Kopplung Die J-Kopplung Spin-Spin Kopplung Spin-Spin Kopplung Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler Magnetfeldstärke Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler Magnetfeldstärke Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, => Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, oder => Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds Da beide Zustände gleichwahrscheinlich => Aufspaltung des Signals in Multipletts Da beide Zustände gleichwahrscheinlich => Aufspaltung des Signals in Multipletts 1 benachbartes Proton => 2 Signale 2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitäten usw. 1 benachbartes Proton => 2 Signale 2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitäten usw. Kopplungskonstante J Kopplungskonstante J Abstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante J Abstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante J Je nach Wert: Abschätzung wie viele Bindungen voneinander entfernt Je nach Wert: Abschätzung wie viele Bindungen voneinander entfernt 2 Bindungen, geminal, 2 J 2 Bindungen, geminal, 2 J 3 Bindungen, vicinal, 3 J 3 Bindungen, vicinal, 3 J

19 19 NMR chemical shift mapping IV ( 1 H, 15 N)-HSQC-NMR-Spektroskopie ( 1 H, 15 N)-HSQC-NMR-Spektroskopie HSQC = Heteronuclear single quantum coherence HSQC = Heteronuclear single quantum coherence 2D-NMR 2D-NMR x-Achse: Verschiebung von H x-Achse: Verschiebung von H y-Achse: Verschiebung von N y-Achse: Verschiebung von N Heteronuclear Single quantum: Heteronuclear Single quantum: Bestimmung der 1 J Kopplung zwischen H und N => direkt verbundene Atome Bestimmung der 1 J Kopplung zwischen H und N => direkt verbundene Atome Kreuzpunkte: Kopplung von H und N Kreuzpunkte: Kopplung von H und N Untersuchung von Proteinen Untersuchung von Proteinen Jede Aminosäure außer Prolin: Kopplungssignal der Amidgruppe Jede Aminosäure außer Prolin: Kopplungssignal der Amidgruppe Ebenso AS-Ketten wegen Peptidbindung Ebenso AS-Ketten wegen Peptidbindung WW zwischen Proteinen WW zwischen Proteinen Bindung von Ligand an 15 N markiertes Protein => Änderung der chem. Verschiebungen Bindung von Ligand an 15 N markiertes Protein => Änderung der chem. Verschiebungen Möglichkeit der Identifizierung der ww. AS bei zugewiesenem Spektrum Möglichkeit der Identifizierung der ww. AS bei zugewiesenem Spektrum

20 20 NMR chemical shift mapping VI Experiment Experiment Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS) Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS) Teilreaktion: Teilreaktion: Übertragung von Phosphor Übertragung von Phosphor Bekannt: Spezifisch für verschiedene Spezies Bekannt: Spezifisch für verschiedene Spezies Betrachtung von B. subtilis und E. coli Betrachtung von B. subtilis und E. coli große Ähnlichkeit in 3D Struktur große Ähnlichkeit in 3D Struktur Homologe WW stark:bsHPR + bsEIIA glc ecHPR + ecEIIA glc Homologe WW stark:bsHPR + bsEIIA glc ecHPR + ecEIIA glc Heterologe WW stark:ecHPR + bsEIIA glc Heterologe WW stark:ecHPR + bsEIIA glc schwach: bsHPR + ecEIIA glc schwach: bsHPR + ecEIIA glc Fragestellung: Fragestellung: Kann NMR chemical shift mapping Spezifität der Reaktionen widerspiegeln? Kann NMR chemical shift mapping Spezifität der Reaktionen widerspiegeln?

21 21 NMR chemical shift mapping VII Versuchsdurchführung Versuchsdurchführung Untersuchung von nicht phosphorylierten Proteinen um Untersuchung von nicht phosphorylierten Proteinen um Mögliche Rückreaktion auszuschließen Mögliche Rückreaktion auszuschließen Phosphohydrolysis auszuschließen Phosphohydrolysis auszuschließen Phosphorylierung hat keine relevanten Auswirkungen auf WW Phosphorylierung hat keine relevanten Auswirkungen auf WW 4 NMR-Experimente 4 NMR-Experimente NMR-Spektren von 15 N-HPR vor (blau) und nach Zugabe (rot) von unmarkiertem EIIA glc NMR-Spektren von 15 N-HPR vor (blau) und nach Zugabe (rot) von unmarkiertem EIIA glc A: ecHPR + ecEIIA glc A: ecHPR + ecEIIA glc B: bsHPR + bsEIIA glc B: bsHPR + bsEIIA glc C: ecHPR + bsEIIA glc C: ecHPR + bsEIIA glc D: bsHPR + ecEIIA glc D: bsHPR + ecEIIA glc

22 22 NMR chemical shift mapping VIII Auswertung Auswertung Keine Verschiebung bei bsHPR + ecEIIA glc (D) => Überlagerung der Kreuzpunkte => keine WW Keine Verschiebung bei bsHPR + ecEIIA glc (D) => Überlagerung der Kreuzpunkte => keine WW Durch Zuordnung der Spektren => Identifizierung von ähnlichen Bindungstellen (schwarz) Durch Zuordnung der Spektren => Identifizierung von ähnlichen Bindungstellen (schwarz) Fazit Fazit Methode geeignet um spezifische WW zu detektieren Methode geeignet um spezifische WW zu detektieren Trotz hoher Konzentrationen (>200 μm) von gereinigtem Protein bei NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch unspezifische WW Trotz hoher Konzentrationen (>200 μm) von gereinigtem Protein bei NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch unspezifische WW

23 23 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm I Idee Idee Protein-Protein Docking Problem Protein-Protein Docking Problem Gegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. B Gegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. B Ermittle 3D-Struktur des Komplexes AB Ermittle 3D-Struktur des Komplexes AB Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D 1 H-NMR-Spektrum als Input Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D 1 H-NMR-Spektrum als Input Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof (1995,1997) Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof (1995,1997) Generiert Liste möglicher Komplexe Generiert Liste möglicher Komplexe Bewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-Funktion Bewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-Funktion Ziel Ziel Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des experimentellen H-NMR-Spektrums miteinbezieht Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des experimentellen H-NMR-Spektrums miteinbezieht

24 24 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm II Neue Scoring Funktion Neue Scoring Funktion Berechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen Komplex Berechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen Komplex Abweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen Spektrum => Bewertung der Komplexe Abweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen Spektrum => Bewertung der Komplexe Berechnung der Chemischen Verschiebung des Komplexes Berechnung der Chemischen Verschiebung des Komplexes Zerlegt Chemische Verschiebung δ in 4 Teile: Zerlegt Chemische Verschiebung δ in 4 Teile: δ RC : Random Coil shift δ RC : Random Coil shift δ A : Magnetic Anisotropy δ A : Magnetic Anisotropy δ JB : Ring current, Ringstromeffekt δ JB : Ring current, Ringstromeffekt δ EF : Electric field effect δ EF : Electric field effect

25 25 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm III δ JB - Electric field effect δ JB - Electric field effect Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden Elektronen Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden Elektronen Spezifisch für jede Bindung, C-H, N-H Spezifisch für jede Bindung, C-H, N-H Konstante ε übernommen von Williamson und Asakura(1993) Konstante ε übernommen von Williamson und Asakura(1993) Elektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von Coulomb Elektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von Coulomb Atomladungen aus dem AMBER 94 Kraftfeld (Connell et al. 1995) Atomladungen aus dem AMBER 94 Kraftfeld (Connell et al. 1995) δ RC – Random coil shifts δ RC – Random coil shifts Verschiebungen von nicht definiert gefalteten As-Ketten Verschiebungen von nicht definiert gefalteten As-Ketten Übernommen aus der BRMB Datenbank Übernommen aus der BRMB Datenbank

26 26 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IV δ A – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung δ A – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen die gleiche Elektronenverteilung Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen die gleiche Elektronenverteilung Oberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der Ebene Oberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der Ebene Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor (Matrix) Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor (Matrix) Kennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen Bindung Kennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen Bindung R: Abstand Proton-Anistropische Bindung R: Abstand Proton-Anistropische Bindung N a : Avogadrosche Zahl N a : Avogadrosche Zahl θ i : Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R θ i : Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R Χ i : Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung Χ i : Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung

27 27 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm V δ JB – Ringstromeffekt δ JB – Ringstromeffekt Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen ungleiche Elektronenverteilung durch π -Elektronen-System Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen ungleiche Elektronenverteilung durch π -Elektronen-System Oberhalb der Ringebene stärker abgeschirmt als in der Ebene Oberhalb der Ringebene stärker abgeschirmt als in der Ebene Äußeres Magnetfeld erzeugt Ringstrom im Aromaten Äußeres Magnetfeld erzeugt Ringstrom im Aromaten Erzeugt seinerseits entgegen gesetztes Magnetfeld Erzeugt seinerseits entgegen gesetztes Magnetfeld Modelliert nach Johnson and Bovey (1958): Modelliert nach Johnson and Bovey (1958): n = Anzahl der π -Elektronen n = Anzahl der π -Elektronen e 0, m = elektrische Ladung und Masse e 0, m = elektrische Ladung und Masse e = Lichtgeschwindigkeit e = Lichtgeschwindigkeit a = Ring Radius (5-Ring 1,182Å ; 6-Ring 1,39Å) a = Ring Radius (5-Ring 1,182Å ; 6-Ring 1,39Å) p, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wieder p, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wieder K,E = komplett elliptische Integrale K,E = komplett elliptische Integrale

28 28 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VI Bestimmung eines theoretischen NMR-Spektrums Bestimmung eines theoretischen NMR-Spektrums Simulation mittels Lorentzschen Linien Simulation mittels Lorentzschen Linien Gesamtspektrum = Linearkombination der Lorentzlinien Gesamtspektrum = Linearkombination der Lorentzlinien W = Linienbreite ( ppm 2 ) W = Linienbreite ( ppm 2 ) P i = Peakposition P i = Peakposition Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in wässriger Lösung vorhanden Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in wässriger Lösung vorhanden Bestimmung der Differenz zwischen experimentellem (S exp ) und simuliertem Spektrum (S epx ) an 5000 verteilten Positionen x i im Bereich (-2 bis +12 ppm) Bestimmung der Differenz zwischen experimentellem (S exp ) und simuliertem Spektrum (S epx ) an 5000 verteilten Positionen x i im Bereich (-2 bis +12 ppm) Normalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendet Normalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendet

29 29 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VII Ziele der Integration von NMR-Daten in RBD-Algorithmen Ziele der Integration von NMR-Daten in RBD-Algorithmen Erhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neue Scoring-Funktion Erhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neue Scoring-Funktion Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte Verschiebungszuweisungen basierend auf Docking-Resultaten Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte Verschiebungszuweisungen basierend auf Docking-Resultaten Evaluierung Evaluierung 4 Komplexe 4 Komplexe Calmodulin + Ca 2+ abhängige Proteinkinase Calmodulin + Ca 2+ abhängige Proteinkinase Calmodulin + Bindungspeptid der Ca 2+ Pumpe Calmodulin + Bindungspeptid der Ca 2+ Pumpe S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein Homodimere Untereinheiten von S100B(ββ) Homodimere Untereinheiten von S100B(ββ) Einzelstrukturen aus PDB Einzelstrukturen aus PDB Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-Datenbank Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-Datenbank

30 30 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VIII Auswertung Auswertung Auftragung der möglichen Komplexe Auftragung der möglichen Komplexe x-Achse: RMSD y-Achse: Atom-Kontakt Energie x-Achse: RMSD y-Achse: Atom-Kontakt Energie Beste Ergebnisse linke untere Ecke Beste Ergebnisse linke untere Ecke Beste Ergebnisse ohne Anisotropieshift => herausgenommen, lokaler Effekt Beste Ergebnisse ohne Anisotropieshift => herausgenommen, lokaler Effekt S100 dimer Cal + Pump S100 + p53 Cal + Kinase

31 31 Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IX Auswertung Auswertung Calmodulin + Ca 2+ abhängige Proteinkinase Calmodulin + Ca 2+ abhängige Proteinkinase Sehr gutes Ergebnis Sehr gutes Ergebnis Calmodulin + Bindungspeptid der Ca 2+ Pumpe Calmodulin + Bindungspeptid der Ca 2+ Pumpe Gutes Ergebnis Gutes Ergebnis Allerdings falsche Struktur auf Platz 1 Grund unbekannt Allerdings falsche Struktur auf Platz 1 Grund unbekannt S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein Gutes Ergebnis Gutes Ergebnis verwunderlich, da mit herkömmlichen Scoring-Funktion nicht zu docken verwunderlich, da mit herkömmlichen Scoring-Funktion nicht zu docken Untereinheiten von S100B(ββ) Untereinheiten von S100B(ββ) Gute Trennung zwischen zwischen True und False Positives Gute Trennung zwischen zwischen True und False Positives Fazit Fazit Evaluation mit mehr Strukturen benötigt Evaluation mit mehr Strukturen benötigt Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-Spektrum Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-Spektrum Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche mehr strukturelle Informationen enthalten Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche mehr strukturelle Informationen enthalten S100 + p53

32 32 Fazit Experimentelle Methoden oft sehr spezifisch Experimentelle Methoden oft sehr spezifisch dienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissen dienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissen unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen Methoden unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen Methoden Nachteile: Nachteile: Erfordern hohes Fachwissen Erfordern hohes Fachwissen Fehleranfällig Fehleranfällig Stark abhängig von experimentellen Bedingungen Stark abhängig von experimentellen Bedingungen Zeit- und Kostenintensiv Zeit- und Kostenintensiv Ausblick: Ausblick: Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen Methoden bringt Vorteil Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen Methoden bringt Vorteil

33 33 Referenzen Phizicky, E.M. and Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, Phizicky, E.M. and Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis. Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis. Kenworthy, A.K., (2001) Methods, 24, Kenworthy, A.K., (2001) Methods, 24, Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy. Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy. Rajagopal, P., Waygood, E.B., Reizer, J., Saier-Jr., M.H., and Klevit, R.E., (1997) Protein Science, 6, Rajagopal, P., Waygood, E.B., Reizer, J., Saier-Jr., M.H., and Klevit, R.E., (1997) Protein Science, 6, Demonstration of Protein-Protein Interaction Specificity by NMR Chemical Shift Mapping. Demonstration of Protein-Protein Interaction Specificity by NMR Chemical Shift Mapping. Kohlbacher, O., Burchardt, A., Moll, A., Hildebrandt, A., Bayer, P., and Lenhof, H.-P., (2001) J. Biol. NMR, 20, Kohlbacher, O., Burchardt, A., Moll, A., Hildebrandt, A., Bayer, P., and Lenhof, H.-P., (2001) J. Biol. NMR, 20, Structure Prediction of Protein Complexes by a NMR-based Protein Docking Algorithm. Structure Prediction of Protein Complexes by a NMR-based Protein Docking Algorithm.

34 34 Ende Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit Fragen, Fragen, Fragen ? ? ? Fragen, Fragen, Fragen ? ? ?


Herunterladen ppt "Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen Presented by Stefan Nickels Proseminar: Theoretical."

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen