Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung

Präsentation zum Thema: "Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung"—  Präsentation transkript:

1 Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung
Reporter-Gen-Assay Molekulare Zellbiologie von Immunzellen Blockpraktikum SS 2008 Referenten: Felix Eppler, Sibylle Molt

2 Einleitung Phosphorylierung der der Tyrosinreste der ITAMs durch Src-Kinasen Rekrutierung der Syk-Kinase ZAP-70 Aktivierung von ZAP-70 durch Tyrosin-Phosphorylierung von Lck und Fyn Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

3 Zap70 Tyrosinkinase  Phosphoryliert die Adapterproteine SLP-76 und LAT (linker of T cell activation) Aktivierung der PL Cγ und Ras-Proteine Ausgelöste Signalkaskade aktiviert die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB  binden an die jeweiligen Erkennungssequenzen im IL-2 Promotor  Induktion der Synthese des IL-2 IL-2 fördert die Proliferation und Differenzierung der T-Zelle

4 Cytohesin-1 Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) für kleine ADP-Ribosylierungsfaktoren Überwiegend in Zellen des hämatopoetischen System exprimiert Wurde als spezifischer Interaktionspartner der β2-Untereinheit (CD18) des Integrins LFA-1 identifiziert (Kolanus et al.)

5 Ziel des Versuchs Untersuchung des Einflusses von Zap70 und Cytohesin-1 auf den IL-2 Reporter und damit auf die T-Zellaktivierung Ist Cytohesin-1 an Signalkaskaden der T-Zellaktivierung beteiligt? Mutanten Zap70K-  inaktive Mutante (dominant negativ) Zap70Y292F  funktionserhöhende Mutante Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

6 Dominant-negative Cytohesin-1 Sec-7 Mutante (Cytohesin-1 E157K) in Jurkat E6 T-Zellen unterbindet nicht nur den GDP/GTP-Austausch an ARF1, sondern auch die LFA-1-vermittelte Adhäsion an ICAM-1 Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

7 IL-2 Reporter-Gen Assay
Hinter der Promotor-Region wurde das IL-2 Gen durch eine Luciferase cDNA ersetzt  Luciferaseexpression wird dadurch u.a. von den Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB kontrolliert Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

8 Luciferase Assay System
Luciferase spaltet das Substrat Luciferin in Anwesenheit von ATP zu Oxyluciferin Die emittierten Photonen können mit Hilfe eines Luminometers detektiert werden Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

9 Versuchsdurchführung
Elektroporation der LT-Zellen mit Marker (GFP), Reporter (IL2) und Test-DNA (Vektorkontrolle, Cytohesin1 wt, Cytohesin1 E157K, Zap70K-, ZAP70Y292F) Stimulation der Zellen für 6 Stunden mit Okt3 (α CD3ε) und PMA (Phorbolester) Überprüfung der Transfektionseffizienz  Bestimmung der GFP-Expression der einzelnen Transfektionen im FACS Messung der Luciferase Aktivität (Luminometer) und Proteinkonzentration (mittels BCA) Excel Auswertung

10 Ergebnisse Als Beispiel: Transfektionseffizienz von Cytohesin-1 E157K ermittelt durch FACS-Analyse (27,66%)

11 Ergebnisse Vektorkontrolle 26,6% ZAP70 K- 19,9% ZAP70 Y292F 20,27%
Transfektionseffizienz Proteinkonzentration (mg/ml) Luciferase Aktivität Vektorkontrolle 26,6% Stim (1): 0,739 Stim (2): 0,803 Us (1): 0,756 Us (2): 0,67 Stim (1): Stim (2): Us (1): 979 Us (2): 1173 ZAP70 K- 19,9% Stim (1): 0,671 Stim (2): 0,87 Us (1): 0,692 Us (2): 0,823 Stim (1): 4553 Stim (2): 4442 Us (1): 516 Us (2): 691 ZAP70 Y292F 20,27% Stim (1): 0,633 Stim (2): 0,686 Us (1): 0,616 Us (2): 0,655 Stim (1): 44713 Stim (2): 51351 Us (1): 823 Us (2): 808 Cytohesin-1 wt 11,7% Stim (1): 0,857 Stim (2): 0,976 Us (1): 0,963 Us (2): 0,846 Stim (1): 59143 Stim (2): 53592 Us (1): 262 Us (2): 309 Cytohesin-1 E157K 27,66% Stim (1): 0,48 Stim (2): 0,88 Us (1): 0,634 Us (2): 0,783 Stim (1): 92826 Stim (2): Us (1): 1712 Us (2): 1770

12 Ergebnisse Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten aus 2 Experimenten

13 Diskussion Vektorkontrolle stimuliert:
IL2-Promotor wird sehr effizient aktiviert Vektor hat keinen Einfluss auf T-Zellaktivierung ZAP70 K- stimuliert: IL2-Promotor wird kaum aktiviert ZAP70 hat eine wichtige Funktion im Rahmen der T-Zellaktivierung

14 Diskussion ZAP70 Y292F stimuliert:
schwache Aktivierung des IL2-Promotors Mutante scheint negative Einwirkung auf die T-Zellaktivierung zu haben Eine erhöhte Aktivierung des IL2-Promotors wäre zu erwarten gewesen (Zeitlmann et al., 1998) Müsste mit einem neuen Ansatz nochmals durchgeführt werden

15 Diskussion Cytohesin-1 E157K stimuliert:
sehr schwache Aktivierung des IL2-Promotors Dominant negative Mutante scheint negativen Einfluss auf T-Zellaktivierung zu haben Cytohesin-1 wt stimuliert: sehr effiziente Aktivierung des IL2-Promotors leichte Steigerung gegenüber der Vektorkontrolle Cytohesin-1 scheint eine Rolle in der T-Zellaktivierung zu spielen