Diskussion Die C13orf19-mRNA-Reduktion durch siRNA-D5 verursacht keine zellulären Effekte auf die PCa-Zelllinie PC-3. Da wir vermuten, dass die Inhibition.

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1 Diskussion Die C13orf19-mRNA-Reduktion durch siRNA-D5 verursacht keine zellulären Effekte auf die PCa-Zelllinie PC-3. Da wir vermuten, dass die Inhibition der C13orf19-mRNA Expression zu einer Verringerung der Apoptoserate in PCa-Zellen führt, werden gegenwärtig Experimente mit Chemotherapeutika durchgeführt. Erste Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Etoposid nicht zu einer Erhöhung der Apoptoserate in PC-3-Zellen führt. Deshalb wird zurzeit ein weiteres Chemotherapeutikum getestet. Material & Methoden An der PCa-Zelllinie PC ‑ 3 wurde die Reduktion der C13orf19- mRNA-Expression nach DOTAP-vermittelter Transfektion von fünf verschiedenen siRNA-Konstrukten (D1: 2245 ‑ 2263 nt; D2: 2215 ‑ 2233 nt; D3: 1024 ‑ 1042 nt; D4: 440 ‑ 458 nt; D5: 1288 ‑ 1306 nt) verglichen. Im Unterschied zu anderen PCa- Zelllinien (Du145, LNCap, 22RV1) weist PC-3 eine höhere C13orf19-mRNA-Expression auf. Nach Optimierung der Transfektionsbedingungen wurde die effizienteste siRNA ausgewählt. Die mRNA-Expression des C13orf19 und des Referenzgenes PBGD wurde mittels quantitativer PCR gemessen und die relativen Expressionen auf die non- silencing (ns) siRNA-Kontrolle normiert. Zur Bestimmung der Zellviabilität wurde WST-1, zur Apoptosemessung Annexin V-Propidiumiodid verwendet. Ebenso wurden Zellzyklusanalysen und Zellkoloniebildungstests durchgeführt. Zusätzlich wurden die Effekte der C13orf19- Inhibierung in Kombination mit Chemotherapeutika (CT) auf das Zellwachstum untersucht. Dafür wurden die Zellen 24 h nach Tf für 24 h mit 20 µM Etoposid behandelt (Abb.1 B). Ergebnisse Die Anwendung der verschiedenen siRNAs zeigte keine offensichtlichen Effekte auf Verdopplungsrate und Zellmorphologie. Alle fünf siRNA-Konstrukte inhibierten die C13orf19-mRNA-Expression (Tab.1). Die effizienteste siRNA ist Duplex D5. Nach 12 h konnte eine durch siRNA-D5 vermittelte Reduktion der C13orf19 mRNA- Expression auf 12% festgestellt werden, die nach 72 h immer noch bei 31% lag. Zellviabilität (Abb.2), Zellzyklusanalyse (Abb.3), Apoptoserate (Abb.6) und Zellkoloniebildungstest zeigten - verglichen mit den Kontrollen - keine Unterschiede. Eine vermutete chemoprotektive Wirkung von siRNA-D5 konnte bisher nicht nachgewiesen werden. Die Zugabe von 20 µM Etoposid zu PC-3-Zellen führte zwar zu einem G2-M-Arrest (Abb.4) jedoch nicht zu einer Apoptoseinduktion (Abb.5). Abb.7 zeigt die Vergrößerung der Zellen als Folge des G2-M-Arrestes. Es gibt keinen signifikanten Unterschied in Apoptoserate und Zellzyklusverteilung zwischen mit siRNA-D5+Etoposid behandelten Zellen und den Kontrollenbehandlungen mit ns-siRNA+Etoposid bzw. Etoposid. http://www.urologie.uniklinikum-dresden.de, *e-mail: doreen.kunze@gmx.de Inhibierung der C13orf19-mRNA-Expression durch siRNA in Prostatakarzinomzellen Doreen Kunze*, Uta Schmidt, Susanne Fuessel, Axel Meye, Manfred P. Wirth Doreen Kunze*, Uta Schmidt, Susanne Fuessel, Axel Meye, Manfred P. Wirth Klinik für Urologie, Technische Universität Dresden, Deutschland Klinik für Urologie, Technische Universität Dresden, Deutschland Einleitung Das Chromosom 13q ist beim Prostatakarzinom (PCa) oft von genetischen Veränderungen betroffen, vor allem von Allelverlusten [1,2]. Das führte zu der Hypothese, dass mindestens ein Prostata-spezifisches Tumorsuppressorgen auf Chromosom 13q lokalisiert ist. In früheren Studien wurde das humane C13orf19 (NM 017569) als im Prostatakarzinom herunterreguliertes Gen identifiziert. Es befindet sich auf dem Chromosom 13q13 zwischen den Tumorsuppressorgenen BRCA-2 und RB-1. Die hauptsächlich epitheliale C13orf19-mRNA-Expression konnte durch in situ-Experimente gezeigt werden [3]. Das mutmaßliche korrespondierende Protein, bestehend aus 733 Aminosäuren, weist aufgrund des Kernlokalisierungssignals und der Glutamin-Cluster am C-Terminus eine starke Ähnlichkeit mit Transkriptionsfaktoren auf. Da die Funktion von C13orf19 bisher nicht bekannt ist, wurde dessen mRNA-Expression in PCa- und BPH-Zelllinien durch DOTAP-vermittelte Transfektion (Tf) mit siRNA inhibiert und die biologischen Auswirkungen dieser Inhibition untersucht. Referenzen [1] R. von Knobloch, L. Konrad, P.J. Barth, H. Brandt, S.Wille, A. Heidenreich, et al., Genetic pathways and new progression markers for prostate cancer suggested by microsatellite allelotyping. Clin. Cancer Res. 10 (2004) 1064-1073 [2] U. Fiedler, W. Ehlers, A. Meye, S. Fussel, G. Faller, U. Schmidt and M.P. Wirth. LOH analyses in the region of the putative tumour suppressor gene C13 on chromosome 13q13. Anticancer Res. 21 (2001) 2341-2350 [3] U. Schmidt, U. Fiedler, C.P. Pilarsky, W. Ehlers, S. Fuessel, M. Haase, G. Faller, G. Sauter, and M.P. Wirth. Identification of a novel gene on chromosome 13 between BRCA-2 and RB-1. Prostate 47 (2001) 91-101 Tab.1 Inhibierung der C13orf19-mRNA-Expression relativ zu PBGD normiert auf ns-siRNA. siRNA-D5 ns-siRNA unbehandelt 3.9 1.6 3.6 1.3 3.5 0.8 Abb.6 Apoptoserate in PC-3- Zellen nach siRNA-Transfektion. Es sind die prozentualen Anteile frühapoptotischer (Annexin V- positiv, PI-negativ; unten rechts) und spätapoptotischer Zellen (Annexin V-positiv, PI-positiv; oben rechts) angegeben. Abb.3 Zellzyklusverteilung der Zelllinie PC-3 nach Transfektion mit 125 nM siRNA Abb.2 Ergebnis des WST-1-Zellviabilitätsteste der Zelllinie PC-3 48 h nach Transfektion Abb.4 Zellzyklusverteilung der Zelllinie PC-3 nach Behandlung mit 250 nM siRNA + 20µM Etoposid 72 h nach Tf Abb.5 Apoptoserate in PC-3-Zellen nach Behandlung mit 250 nM siRNA + 20 µM Etoposid 72 h nach TF Zeit nach TF-Start in h Inhibierung der C13orf19-mRNA-Expression normiert auf ns-siRNA siRNA-D1siRNA-D2siRNA-D3siRNA-D4siRNA-D5 1242 %49 %22 %55 %12 % 2450 %58 %40 %56 %16 % 4845 % 32 %67 %23 % 7256 %50 %36 %93 %31 % Abb.1 Behandlungsschema von Pca-Zellen in vitro. (A) DOTAP-vermittelte Transfektion mit 250 nM siRNA (B) Kombinationsbehandlung von siRNA mit Chemotherapie AussaatTransfektion (4 h) WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest 24 – 72 h20 – 68 h AussaatTransfektion (4 h) CT (24 h) WST-1-Test Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest 24 – 72 h20 h24 – 72 h (A) (B) A B Abb.7 PC-3-Zellen (125fache Vergrößerung) (A) 250 nM siRNA-D5 (B) 250 nM siRNA-D5 + 20 µM Etoposid