Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien Doreen Kunze 20.05.05 Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften.

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1 Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien Doreen Kunze 20.05.05 Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden

2 Ziele 1.Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene 2.Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK 3.Hormonabhängigkeit der P38IP-mRNA- Expression

3 1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung) Prostatakarzinom (PCa) häufigste Krebserkrankung bei Männern zweithäufigste Krebs-Todesursache Lebenszeitrisiko: –Zu erkranken: 9,6 % –Zu sterben: 3,2 % Häufigkeitsgipfel zw. 70 – 75 Lebensjahr genetisch sehr heterogen

4 1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung) P38IP C13ORF19, Fam48A lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen mRNA-Expression im PCa reduziert Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe: verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression Chromosom 13 13 RB1 C 13 BRCA2 In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP Schematische Darstellung des längsten offenen Leserahmens im P38IP-Gen und das abgeleitete Proteinmuster. PEST-RegionKernlokalisierungssignal Glutamin-Cluster  -Helix-Region 733 AA C N

5 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse: h nach TF-Start siRNA- D1 siRNA- D2 siRNA- D3 siRNA- D4 siRNA- D5 1242 %49 %22 %55 %12 % 2450 %58 %40 %56 %16 % 4845 % 32 %67 %23 % 7256 %50 %36 %93 %31 % Aussaat (PC-3, BPH-1) Transfektion (4 h) 24 – 72 h WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest Western Blot 20 – 68 h Tf mit 250 nM siRNA: 24 h nach Tf:

6 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse) unbehandelt 48 h siRNA-D5 48 h 5,5 % ns-siRNA 48 h 4,9 %4,3 % Apoptosemessung (FACS) - Tf mit 125 nM siRNA Zellkoloniebildungstest WST-Test 48 h nach Tf

7 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)  langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression  keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte

8 1.2 Chemoprotektion (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse: CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h) Aussaat (PC-3) Transfektion (4 h) 24 – 72 h20 h WST-1-Test Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest 24 – 72 h WST-1-Test: 96 h nach Tf

9 1.2 Chemoprotektion (Ergebnisse) A B 125fache Vergrößerung A: PC-3 siRNA-D5 B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid  Zellzyklusarrest, keine Apoptoseinduktion

10 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Einleitung) P38IP = p38MAPK interacting protein MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase intrazelluläre Signalübertragung (Proteinkinasen-Kaskaden) streßaktiviert 4 Isoformen (α, β, γ, δ) SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle

11 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse: Aussaat (PC-3, BPH-1) DMEM ohne FKS 24 – 72 h Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Western Blot (HSP27) 10 – 60 min SB203580 (0,5 – 8 µM)  kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK erkennbar

12 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse, Ausblick) Ergebnisse: HSP 27 ß-Actin  HSP27 ist kein geeigneter Nachweis für p38MAPK-Inhibition Ausblick: Einfluss von siRNA-D5-Behandlung auf p38MAPK ? (Western Blot mit AK gegen p38MAPK)

13 3. Hormonabhängigkeit (M & M, Ergebnisse) M & M: Ergebnisse:  P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig AussaatHormonfreies Medium 24 h 3 – 48 h Androgen R1881 (+ Casodex) 24 h RNA-Isolierung + qPRC

14 Zusammenfassung Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !  langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression  keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte  kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK  P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig