Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008 Referent: Marcell Louis Ergebnispräsentation: „ Klonierung von Cytohesin-Mutanten “

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008 Referent: Marcell Louis Ergebnispräsentation: „ Klonierung von Cytohesin-Mutanten “"—  Präsentation transkript:

1 Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008 Referent: Marcell Louis Ergebnispräsentation: „ Klonierung von Cytohesin-Mutanten “

2 Klonierung von Cytohesin-Mutanten : E157K R281K V. a. zur Strukturaufklärung von Proteinen Einführung von Punktmutation in Cyh-1

3 PCR-Mutagense : 1. Schritt: 2. Schritt: E157K 471bp 723bp R281K 843bp 351bp 1,194 kb ( Splicing by Overlap-Extension)

4 Gelbilder der PCR-Mutagenese und SOEing-PCR: E157K 351bp R281K 843bp 723bp 471bp Mutagenese: SOEing: E157K R281K 1194bp Daraufhin: Reinigung (CHCl 3 /Phenol) + Fällung Marker

5 Verdau : Restriktionsenzyme: Mlu I A/CGCGT Not I GC/GGCCGC Cyh-1 (mutiert) MluI NotI Kontrolle des Verdaus MarkerVerdaukontrollen ~ 1,2 kb 4,7 kb Nach Verdau: Dephosphorylierung der 5‘-Enden verringert Religationswahrscheinlichkeit

6 Verdau-Kontrolle des Plamids : Marker Verdau-Kontrollen der Vektoren Low-Melting-Gel erleichtert Isolierung der DNA Isolierung durch Exzision unter UV-Licht 4,2-4,9kb Unverdaut er Vektor Vektor (verdaut) 4,7 kb

7 Ligation/Transformation/‘Minipräp‘ : Isolierte Insert- und Verktorstränge : Hitzeschock T4-DNA-Ligase Ampicillin Minipräparation

8 Testverdau der ‚Minipräp‘: Verdau ~ 1,2 kb 4,7 kb ~ 1,2 kb Marker Ansätze/ Klone Klone erfolgreich DB

9 Testverau/‚Minipräp‘: Erfolgreiche Klone werden in größerem Maßstab angezüchtet Aus der sog. Maxipräparation reinigt man die Plamide auf (CsCl-Gradient) Zum Schluss: DNA-Konzentrationsbestimmung im Fotometer: (Ergebnis leider sehr niedrig, also kein Paradebeispiel)

10 Ende: Vielen Dank! Außerdem bedanke ich mich bei ‚Wikipedia‘, aus der ich meine (umgeänderten) Abbildungen benutze.


Herunterladen ppt "Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008 Referent: Marcell Louis Ergebnispräsentation: „ Klonierung von Cytohesin-Mutanten “"

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen