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Analytische Ultrazentrifugation (AUZ) Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue Methodenseminar, Januar 2007.

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Präsentation zum Thema: "Analytische Ultrazentrifugation (AUZ) Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue Methodenseminar, Januar 2007."—  Präsentation transkript:

1 Analytische Ultrazentrifugation (AUZ) Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue Methodenseminar, Januar 2007

2 Aufbau der Analytischen Ultrazentrifuge Sedimentationslauf (Sedimentationsgeschwindigkeitslauf) Gleichgewichtslauf (Sedimentationsgleichgewichtslauf) Gliederung

3 Fragestellung Homogenität der Probe (Sedimentationslauf) Sedimentationskoeffizient (Sedimentationslauf) Molekulargewicht (Gleichgewichtslauf)

4 Analytische Ultrazentrifuge (AUZ) AUZ: ; Rotor: ; Zelle ca max rpm Probe: 450 µl

5 Optische Systeme Probenkonzentration /-verteilung kann während des Laufes verfolgt werden Absorptionsoptik Interferenzoptik Wellenlänge frei wählbar ( nm) Probe muss Chromophor sein OD( )= Probe muss kein Chromophor sein Unterschiedliche Brechungsindizes (Probe und Lösungsmittel) Geringere Empfindlichkeit -> höhere Proteinkonzentration (mind. 1mg/ml) Schlierenoptik Laser 675 nm

6 Analytische Ultrazentrifuge (AUZ) Schlitten Absorption Aufhängung Rotor Linsensystem Interferenz Aufhängung Optik Radiometer

7 Strahlengang

8 Sedimentation Wirkende Kräfte Experiment Auswertung Van Holde Weischet Analyse

9 Sedimentation Wie setzt sich der Sedimentationskoeffizient zusammen?

10 Sedimentationskoeffizient F z = Zentrifugalkraft m p = Partikelmasser = radialer Abstand Partikel zu Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit Wirkende Kräfte: F z ist dem Schwerefeld proportional F z nimmt im Verlauf der Sedimentation zu Wirkende Kräfte

11 Sedimentationskoeffizient F z = Zentrifugalkraft F b = Auftriebskraft Wirkende Kräfte: F b wirkt F z entgegen abhängig von Lösungsmittel Wirkende Kräfte m p = Partikelmasser = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeitm Lm = Masse des verdrängten Lsg.mittels V p = Teilchenvolumenρ Lm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens

12 Sedimentationskoeffizient F z = Zentrifugalkraft F b = Auftriebskraft F f = Reibungskraft Wirkende Kräfte: F f wirkt F z entgegen f ist abhängig von Form, Größe und Hydratation des Partikels Zwischen den drei Kräften stellt sich ein Gleichgewicht ein (< 1 ms) Wirkende Kräfte m p = Partikelmasser = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeitm Lm = Masse des verdrängten Lsg.mittels V p = Teilchenvolumenρ Lm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchensv= Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizientk= Boltzmann Konstante T= TemperaturD= Diffusionskoeffizient

13 Sedimentationskoeffizient F z = Zentrifugalkraft F b = Auftriebskraft F f = Reibungskraft Wirkende Kräfte: Wirkende Kräfte m p = Partikelmasser = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeitm Lm = Masse des verdrängten Lsg.mittels V p = Teilchenvolumenρ Lm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchensv= Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizientk= Boltzmann Konstante T= TemperaturD= Diffusionskoeffizient

14 Einheit: = 1 S [Svedberg] Sedimentationskoeffizient F z = Zentrifugalkraft F b = Auftriebskraft F f = Reibungskraft Wirkende Kräfte: Wirkende Kräfte m p = Partikelmasser = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeitm Lm = Masse des verdrängten Lsg.mittels V p = Teilchenvolumenρ Lm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchensv= Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizientk= Boltzmann Konstante T= TemperaturD= Diffusionskoeffizient

15 Sedimentation Welche Informationen liefert das Sedimentationsexperiment ?

16 Sedimentationsexperiment mögliche Erkenntnisse Bestimmung des/der Sedimentationskoeffizienten s Aussage über Zusammensetzung bzw. Reinheit der Probe (homogen, heterogen) Aussage über die partielle Konzentration der einzelnen Komponenten

17 Sedimentationsexperiment Vorab: Überlegungen ? In welchem Puffer soll Protein/Partikel gelöst sein ? z.B.: TRIS absorbiert bei 205 nm sehr stark, Phosphatpuffer nicht ? Bei welchen Wellenlängen möchte ich messen ? z.B.: 280 nm aromatische AS, 205 nm Peptidrückgrad ? Bei welcher Geschwindigkeit soll gemessen werden ? abhängig von MW; so hoch wie möglich, um die Diffusion an der Sedimentationsfront zu minimieren, ABER: es werden für eine gute Auswertung mind Scans für benötigt; im Zweifel mehrere Läufe bei unterschiedl. Geschwindigkeiten ? Wie viele Scans in welchem zeitlichen Abstand? so viele Scans wie möglich über die komplette Probenzelle in kurzem zeitlichen Abstand

18 Sedimentationsexperiment Vorbereitungen Doppelsektorzelle Reference = Lösungsmittel, 420 µl Sample = Probe in Lösungsmittel, 400 µl - unterschiedliche Befüllung wichtig für Messung der Menisken - sektorförmige Messzelle vermeidet Konvektionen Zelle zusammenbauen, befüllen und in Rotor einsetzen Rotor in Zentrifuge einsetzen, Optik einschrauben Zentrifuge starten und Vakuum ziehen lassen mind. 30 min bei geringer Geschwindigkeit (ca rpm) einlaufen lassen, um konstante Temperatur zu erreichen Experiment starten Dauer: ca. 3 – 4 h

19 Sedimentationslauf Rohdaten r m = Radius Meniskusr bnd = boundary (Wendestelle der Sedimentationsfront) r b = Radius Boden Probe Lösemittel radiale Verdünnung durch sektorförmige Messzelle

20 Auswertung Programm: Ultrascan Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) 1.Editieren des Rohdatensatzes (Anzeige der Menisken und des Plateaus)

21 Auswertung Programm: Ultrascan Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) 1.Editieren des Rohdatensatzes (Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte (boundary) auszuschließen)

22 Auswertung Programm: Ultrascan Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) 1.Editieren des Rohdatensatzes (Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte (boundary) auszuschließen) 2.Auswertung der bearbeiten Daten mit der Enhanced Van Holde-Weischet Analyse (vHWA)

23 Auswertung vHWA Noch mal ein bisschen Theorie: Die Van Holde Weischet Analyse (vHWA)

24 Auswertung Warum vHWA? korrigiert für Diffusionseffekte Möglichkeit der besseren Auswertung von heterogenen Proben und Proben mit zwei oder mehr gut voneinander getrennten Komponenten Auswertung von Datenpunkten in Zell-Bodennähe und von Scans ohne stabiles Plateau möglich Warum van Holde Weischet?

25 Auswertung vHWA Verbreiterung der Sedimentationsfront (Boundary Spreading) : Diffusion vs. Heterogentiät Partikel unterliegt im Zentrifugalfeld ungerichteter und gerichteter Diffusion Ungerichtet: BROWNsche Molekularbewegung Gerichtet/wechselseitig: Konzentrationsgefälle an der Sedimentationsfront führt zu einer Verbreiterung der Sedimentationsfront = Vortäuschung breiter S-Verteilung; allerdings überwiegt mit vorschreitender Zeit die Sedimentation die Diffusion

26 Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Probe mit nur einer einzigen sedimentierenden Komponente

27 Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Probe mit mehreren Komponenten

28 Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität

29 Auswertung vHWA Berechnung der apperenten Sedimentationskoeffizienten

30 Auswertung vHWA Extrapolationsplot

31 Auswertung vHWA Distributionsplot

32 Auswertung vHWA: Originaldaten

33 Gleichgewichtslauf am Beispiel eines Einkomponentensystems

34 Gleichgewichtslauf Konzentrationsreihe Probenmeniskus Lösungsmittelmeniskus 3x identische Probe 100µl 3x identischer Puffer 120 µl

35 Gleichgewichtslauf rpm rpm rpm 0 h Diffusion Sedimentation Im Gleichgewicht kein netto-Stofftransport

36 Gleichgewicht ist abhängig von… Diffusion Sedimentation Molekulargewicht Pufferviskosität Länge der Flüssigkeitssäule Temperatur Winkelgeschwindigkeit Meniskus: darf kein Protein enthalten, Aber auch keine vollständige Sedimentation!

37 Gleichgewichtslauf MP=Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R= allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρ LM = Lösemitteldichte T= Temperaturω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachsec = Konzentration

38 Gleichgewichtslauf- lineare Auswertung Ergebnis: kDa M P = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R= allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρ LM = Lösemitteldichte T= Temperaturω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachsec = Konzentration

39 Gleichgewichtslauf- Global Fit MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R= allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρ LM = Lösemitteldichte T= Temperaturω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachsec(r) = Konzentration am Punkt r A= AmplitudeB = Baseline = Parameter können freigegeben werden

40 Gleichgewichtslauf- Global Fit

41

42 Gleichgewichtslauf: stationärer Zustand => Molekulargewicht mit hoher Genauigkeit Sedimentationslauf: Informationen über Sedimentationskoeffizient, Reinheit und Zusammensetzung der Probe Zusammenfassung

43 Vorteile Hydrodynamische Methode: Proteine in Lösung; kein Kontakt mit Trägermaterialien Gemische können analysiert werden Kein/kaum Probenverlust Absolutmethode: keine Kalibrierung –Masse –Größe –Dichte

44 Literatur Software


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