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MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA.

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1 MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)

2 MARKER-Typen 1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von Unterschied 2. RFLP: restriction fragment length polymorphism 3. AFLP: amplified fragment length polymorphism 4. SSLP: simple sequence length polymorphism 5. SSR: simple sequence repeat (Mikrosatellit) 6. SNP: single nucleotide polymorphism 7. CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences 8. RAPD: random amplified polymorphic DNA

3 2. RFLP Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen Gelanalyse Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahl der Restriktionsfragmente aber nicht gesehen werden. Zusätzliche Restriktionsschnittstelle

4 Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus 2. RFLP

5 2. RFLP SONDE Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt Autoradiogramm

6 2. RFLP ERSTELLUNG 1.Klonierung eines beliebigen (genomischen) Fragments = Sonde 2.Restriktionsverdau genomischer DNA der beiden Individuen mit einem identischen Satz von Restriktionsenzymen 3.Gelelektrophorese und Blotten der verdauten DNAs 4.Hybridisierung des Blots mit der radioaktiv markierten Sonde 5.Autoradiographie und Identifizierung eines Restriktionsverdaus, der einen Poly-morphismus zeigt

7 3. AFLP amplified fragment length polymorphism Grundsätzlich: Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen werden ausgenutzt IM GEGENSATZ ZUM RFLP 1.werden Restriktionsenzyme eingesetzt, die neben 6 auch nur 4 bp erkennen, d.h. die durchschnittliche Fragmentlänge sinkt von ca auf etwa 250 bp. Statt Agarosegelen werden Polyacrylamidgele Elektrophorese eingesetzt. 2.wird statt der Sonden-Technik das Display- Prinzip verwendet, d.h. statt aller möglichen Restriktionsfragmente (16x mehr als beim RFLP) wird durch ein entsprechendes Verfahren nur eine Teilmenge der Fragmente erzeugt, deren Zahl sich bei der Gelelektrophorese gerade noch auftrennen lässt. Aus diesem Grund wird keine Sonde benötigt. Display-Verfahren, auf DNA und RNA anwendbar

8 3. AFLP

9 3. AFLP SPEZIFISCHE PCR PCR Primer 1 < AC GACGT GATT......TGTC TAA NNNNN.....NNNNN CTGCA CTAA....ACAG ATT NNNNN.....NNNNN GACGT GATT.. TGTC TAA TC > PCR Primer 2 [MseI] [PstI]

10 3. AFLP SPEZIFISCHE PCR Über- Anteil Genom Pflanze hang ampl bp 1 1/4 2 Bakterien 2 1/16 8 Bakterien 3 1/64 32 Hefe 4 1/ Arabidopsis 5 1/ Reis 6 1/ Zuckerrübe 7 1/ Gerste 8 1/ Weizen

11 4. SSLP simple sequence length polymorphism - PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik) - Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern überdeckt und mittels PCR amplifiziert - Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und verglichen.

12 4. SSLP Insertion Autoradiogramm Primer I Primer II (Analog Deletion)

13 5. SSR simple sequence length polymorphism Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Di- und Trinukeotidsequenzen (TG) 10 (TG) 12 ENTSTEHUNG Stottern der Polymerase bei der Replikation VORTEIL Schnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h. auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie

14 5. SSR IDENTIFIZIERUNG 1.Anlegen einer Bibliothek kurzer genomischer Fragmente in E. coli Plasmiden 2.Übertragen der Kolonien auf Nylonmembranen 3.Hybridisieren mit SSR-Oligonukleotiden, wobei selbstkomplementäre Sequenzen ([CG] n und [AT] n ) ausgeschlossen sind 4.Sequenzieren positiver Klone 5.Design und Synthese von PCR-Primern 6.Überprüfen, ob Polymorphie des amplifizierten Fragmentes für die interssierenden Varietäten vorliegt

15 6. SNP single nucleotide polymorphism Unterschied in einem einzigen Basenpaar A C VORTEIL SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller Basenpaare)

16 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit

17 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit

18 A B C

19 7. CAPS Cleaved amplified polymorphic sequences ACAC neue Schnittstelle primer Genom 1 Genom 2 1. PCR-Amplifizierung 2. Restriktionsverdau 3. Gelelektrophorese Genom 2Genom 1 Gelektrophorese

20 8. RAPD random amplified polymorphic DNA Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente Genom Individuum 1 Genom Individuum 2 Gelanalyse

21 2. Diagnostik und Pflanzenschutz - Viroide - Viren - Bakterien - Pilze

22 Molekulare Diagnostik und Pflanzenschutz 1. Nachweis der Pathogenfreiheit für kommerzielle Zwecke 2. Absicherung der Pathogenfreiheit im Ausgangsmaterial für Züchtungszwecke 3. Allgemeine phytosanitäre Überwachung Ökonomische Aspekte der Methodenwahl 1. Zeitaufwand, besonders Lohnkosten 2. Automatisierbarkeit 3. Materialkosten

23 1. Viroide Ein Viroid ist ein infektiöses Molekül, das aus einer einzelsträngigen, zirkulären (nur 150–400 Nukleotide) RNA besteht. Dem Viroid fehlt vor allem die Proteinhülle eines normalen Virus. Viroide kommen in der Natur als Krankheitserreger von Pflanzen vor (Pflanzenpathogen). Im Gegensatz zu Viren tragen Viroide keine Gene. Sie codieren also keine Proteine, weshalb Viroide bei ihrer Replikation und ihrem Transport ausschließlich auf Enzyme der Wirtspflanzen angewiesen sind. Der Infektionsmechanismus der Viroide ist bisher unklar. Allerdings wurden Nukleotidsequenzen in der Wirtspflanzen-DNA gefunden, die komplementär zu den Sequenzen der Viroide sind. Hierbei wäre also denkbar, dass das Viroid selbst als primärer Pathogenitäts-Effektor wirkt. Alternativ wird diskutiert, dass Viroide ihre Pathogenität durch "RNA silencing" erlangen.

24 1. Viroide Die meisten Viroide tauchen in Kulturpflanzungen auf bzw. sind dort am meisten verbreitet. Ein gutes Beispiel ist das Kartoffelspindelknollen-Viroid (Abk. PSTVd), welches Kartoffeln, Tomaten und viele andere Pflanzenarten befällt und großen wirtschaftlichen Schaden anrichtet.

25 1. Viroide Molekulare Nachweismöglichkeit: - Bereits 1981 wurde Viroid-RNA (als cDNA) in einem Vektor kloniert und nach radioaktiver Markierung als Hybridisierungssonde verwendet. - Ursprünglich hat die Notwendigkeit der radioaktiven Markierung die Anwendung in breitem Massstab verhindert. - Heute ist nicht-radiokative Markierung kein Problem mehr, der finan- zielle Aufwand hat solche und ähnliche Methoden bisher jedoch nicht zum Einsatz kommen lassen.

26 1. Viroide Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese nativ denat. Largely internally base-paired viroid RNA

27 1. Viroide Bidirektionale Gelektrophorese mit nachfolgender Silberfärbung hat dieselbe Empfindlichkeit wie Hybridisierungstechniken (5 ng/ g Frischgewicht), ist jedoch wesentlich billiger. Außerdem braucht man nicht jedesmal eine neue Sonde, wenn Ein anderes Viroid zu bestimmen ist.

28 2. Viren Hybridisierungstechniken sind möglich, auch PCR-gestützte Methoden sind beschrieben und werden in der Forschung verwendet. In den Großtests jedoch sind diese Methoden zu teuer. Ein Testverfahren, dass von den Hüllproteinen der Viren Gebrauch macht, wird hingegen wegen der geringen Kosten im Routinetest eingesetzt.

29 2. Viren Enthalten Hüllproteine, gegen die Antikörper erzeugt werden können.

30 2. Viren Trübungsmessung, automatisierbar Polyklonale Antikörper

31 3. Bakterien Saprophytische Bakterien überdecken meist pathogene Bakterien. Im Routinetest kann man nicht axenisch arbeiten.

32 3. Bakterien Bindung der Bakterien mittels Antikörper an Magnetpartikel.

33 3. Bakterien Entfernung der Targets mit einem Magneten. Kultivierung der isolierten Bakterien. Klassischer Nachweis.

34 3. Bakterien

35 4. Pilze Anwendungsbeispiel: Schwarzfusskrankheit bei Cruciferen (Kreuzblütengewächse) z. B. Raps und Kohl Infektion durch den Pilz Leptospaeria Maculans Unterscheidung aggressiv/ nichtaggressiv ResitentEmpfänglich

36 4. Pilze Besonders erfolgreich in letzter Zeit hat sich der Einsatz von Antikörpern gegen Komponenten der Zellwand aus Mycel und Sporen entwickelt. Je nach Spezifität kann man auf diese Weise gattungs- oder artspezifische Nachweise führen. Zunehmend gewinnen aber PCR-gestützte Methoden zum Pilznachweis an Bedeutung.

37 4. Pilze RAPD


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