II. Proliferation/Stammzellen WS 2008/2009

Identität embryonaler neuraler Vorläuferzellen

Proliferation neuroepithelialer Zellen

Aus neuroepithelialen Zellen entstehen Radiale Gliazellen Radiale Gliazellen sind neuronale Vorläuferzellen

Zellteilungsmuster der radialen Gliazellen P/N asymmetrisch P/P symmetrisch

Neuronen enstehen in der VZ und wandern entlang von radialen Gliazellen zur Cortex

Wie können Neuronen entlang radialer Gliazellen wandern wenn radiale Gliazellen sich teilen? Wie teilen sich radiale Gliazellen?

Asymmetrische Zellteilung radialer Gliazellen und Wanderung der neuronalen Tochterzelle TuJ1/GFP

Zellteilungsmuster ändern sich während der Entwicklung P/P symmetrisch P/N asymmetrisch N/N symmetrisch Innere Kortex (4-6) durch VZ-Proliferation Äussere Kortex (1-3) durch SVZ-Proliferation

Zellzykluslänge vergrößert sich während der Entwicklung

Hypothese: Die Veränderung des Zellteilungsmusters (P/P vs P/N vs N/N) wird durch Zellzykluslänge (G1-Phase) gesteuert Fakt: In neurogenen P werdenFaktoren exprimiert, die den Zellzyklus verlangsamen (Tis21, BM88) Modell: Neuronale Zell- Fate-Determinanten werden asymmetrisch auf die Tochterzellen vererbt. Wirksamkeit von G1-Länge abhängig!

Wo und wie lange findet Zellproliferation während der Entstehung des Nervensystems statt?

Proliferation im Nervensystem: Analyse durch 3H-Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung (birthdating) Methode: Pulsmarkierung durch 3H-Thy oder BrdU während der Neurogenese - wird in DNA eingebaut. Histologische Analyse unmittelbar nach Pulsmarkierung - identifiziert Zellen in S-Phase Histologische Analyse im adulten Gewebe identifiziert Zellen, die sich zum Zeitpunkt der Pulsmarkierung zum letzten Mal ge- teilt haben. sich weiter teilenden Zellen werden nicht markiert wg. Ausverdünnung von BrdU/3H-Thy

Proliferation im Nervensystem: Analyse durch 3H-Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung (birthdating) Ergebnisse: Neurale Zellen entstehen in Proliferationszonen (VZ, SVZ) Es entstehen zunächst Nervenzellen (VZ), dann Gliazellen (SVZ). Die verschiedenen Nervenzellen werden in bestimmter Reihenfolge in den Proliferationszonen gebildet Nervenzellen entstehen ausschließlich während der Embyronalentwicklung, aber...

Proliferationszonen Ventrikulärzone Externe Körnerschicht Subventrikulärzone

Inside-out Muster der Neurogenese im Cortex P. Rakic

Proliferation im adulten ZNS Riechepithel Proliferation und Apoptose von Nervenzellen im Singzentrum beim Vogel Subventrikulärzone (SVZ), Vorläufer von Neuronen im olfaktorischen Bulbus Hippokampus (Gyrus dentatus), Subgranulärzone produziert Körnerzellen im Gyrus dentatus

Proliferation im adulten CNS: SVZ 30 000 Zellen/Tag

Proliferation im adulten CNS: SVZ

Proliferation im adulten ZNS: Hippokampus von Säugern incl. Primaten 150 Zellen/Tag

Proliferation im adulten ZNS: Hippokampus beim Menschen

SVZ (Maus) 30 000 Zellen/Tag - Ersatz von absterbenden Zellen im olfaktorischen Bulbus - 60% der Zellen werden ersetzt innerhalb von 18 Monaten DG (Maus) 150 Zellen/Tag - Zusätzliche Zellen im Gyrus Dendatus - 10% der Zellen zusätzlich innerhalb von 18 Monaten

Eigenschaften der proliferierenden neuronalen Vorläufer im adulten CNS - handelt es sich um Stammzellen?

Stammzelleigenschaften (Hämapoietisches System) 1. proliferieren während der gesamten Lebensdauer der Organismus 2. produzieren identische Nachkommen (selbstreplizierend). 3. produzieren eine grosse Anzahl von unterschiedlichen Nachkommen (multipotent) durch Progenitor/Vorläufer-Zellen (transient amplifying cells), die nur eine bestimmte Zahl von Zellteilungen durchlaufen und ein eingeschränktes Entwicklungspotential besitzen. 4. Multipotenz bleibt erhalten während der Lebensdauer des Organismus. 5. Eine einzelne Stammzelle kann das gesamte Gewebe regenerieren. Eine selbstreplizierende Zelle die mindestens zwei unterschiedliche Nachkommen produziert (Temple).

Eigenschaften der proliferierenden neuronalen Vorläufer im adulten CNS - handelt es sich um Stammzellen? kontinuierliche Produktion von Neuronen Selbstreplikation in klonalen Kulturen (Neurosphären)

Stammzellkulturen aus dem ZNS FGF/EGF FGF/EGF Differenzierung in vitro Differenzierung in vivo Nach Implantierung in embryonales oder adultes Nervengewebe Entfernung von Proliferationsfaktoren Zugabe von Differenzierungs- Faktoren (CNTF-Astrozyten) Klonale Kulturen

Abnahme ‚früher‘und Zunahme ‚später‘ Stammzellen in Neurosphärenkulturen ≠ adulte Stammzellen in Stammzell-Nische

Identifizierung/Charakterisierung adulter neuraler Stammzellen

SVZ Stammzellen und Vorläuferzellen GFAP+ GFAP- GFAP- Dbx+ Dbx+ PSA-NCAM GFAP promotor-abhängige - virale Infektion oder - GFP-expression oder

Hippocampus Neurogene region im Vogelgehirn Vergleichbare Eigenschaften der Stammzellen in der Subgranulärzone im Hippokampus und in der neurogenen Zone beim Zebrafinken GFAP-promotor dependent infection Hippocampus Neurogene region im Vogelgehirn

Vergleichbare Umgebung der Stammzellen in der Subgranulärzone im Hippokampus und in der SVZ: ‚Stammzell-Nische‘ SVZ Hippocampus Seminar

SVZ Stammzell-Nische B-Zelle (ca 6000/LV) A-Zelle Blutgefäß

Neu produzierte Neuronen im adulten CNS sind funktionell - Zebrafink HVC Neuron im HVC antwortet auf akkustische Stimuli und ist 3H-Thymidin-markiert

Neu produzierte Neuronen im adulten CNS sind funktionell - Hippokampus

Zusammenfassung Aus der SVZ (B-Zellen) können Neurosphären gewonnen werden, die über lange Zeiträume passagiert werden können und somit selbst-replizierend sind Klonale Neurosphären enthalten pluripotente Zellen Diese Zellen bleiben im adulten Tier erhalten Somit sind also GFAP+ SVZ ( B-Zellen) neurale Stammzellen

Was ist die Funktion der Neurogenese im adulten Gehirn?

Die Produktion neuer Neuronen im HVC ist für das Erlernen neuer Lieder beim Zebrafink/Canary erforderlich Neuronen werden ersetzt

Adulte Neurogenese im Hippocampus ist wichtig für Lernen und Gedächtnis (Hippocampus-abhängiges räumliches L.) Anregende Umgebung (‚enriched environment‘) und Laufen erhöht Neurogenese, Lernvermögen und LTP Maus-Stämme mit erhöhter hippokampaler Neurogenese (C7Bl6) zeigen besseres räumliches Lernverhalten als Maus-Stämme mit niedriger Neurogenese (DBA/2)

Adulte Neurogenese im Hippocampus ist wichtig für Lernen und Gedächtnis BrdU-labeled cells Control 1,409 ± 132 Runners 3,746 ± 800*

Neue olfactorische Neuronen aus der SVZ (I) - sind für Geruchsdiskrimination wichtig Gheusi et al., 1999

Neue olfactorische Neuronen aus der SVZ (II) ‚neue‘ Neuronen reagieren besser auf unbekannte olfaktorische Stimuli, (Macklis, unpublished; single cell analysis) Neue olfaktorische Neuronen aus der SVZ (III) Zahl der Neuronen nimmt zu in Umgebung mit olfaktorischen Stimuli - bessere Geruchsdifferenzierung (Rochefort et al., 2002)

Kontrolle adulter Neurogenese - Genetische Unterschiede-Maus-Stämme Enriched environment Running Hormone (Stress) Wachstumsfaktoren (FGF, EGF) Läsion (e.g. Hirnschlag) - spielt Neurogenese eine Rolle bei Regeneration??

Neurale Stammzellen und Stammzell-Therapie A: Aktivierung endogener Stammzellen (Macklis) B: Injektion exogener Stammzellen oder aus Stammzellen gewonnener Zellen.

Implantierung von Neurospären-Zellen in das adulte CNS - im Hippokampus und SVZ: Neuronen - in andere Gehirnregionen: Glia Stammzell-Nische

Implantierung von Stammzellen in adultes CNS - in Regionen mit Läsion, apoptotischem Zelltod (II/III): Neuronen - in Regionen ohne Läsion: Gliazellen

Implantierte immature Neuronen differenzieren zu glutamatergen Neuronen und innervieren die korrekte Zielregion

Läsion in Cortex-Schicht VI

Endogene Stammzellen differenzieren zu Neuronen nach Läsion in Schicht VI

Endogene Stammzellen differenzieren zu Neuronen nach Läsion in Schicht VI

Neurale Stammzellen und Zell-Therapie A: Aktivierung endogener Stammzellen (Macklis) B: Injektion exogener Stammzellen oder aus Stammzellen gewonnener Zellen.

Modelle neuronaler Degeneration

Parkinsonsche Krankheit Degeneration dopaminerger Neuronen der Substantia nigra, (projizieren zum Striatum) Verbesserung des klinischen Befunds durch Implantierung von Zellen aus der fötalen Substantia nigra. Korrelation mit Überleben der implantierten Zellen und Innervation des Striatums. In vitro Vermehrung von Zellen aus der S. nigra - Test im Tiermodell

Parkinsonsche Krankheit

Parkinsonsche Krankheit:Tiermodell

Implantierung von Vorläuferzellen aus der S. Nigra in Striatum-Läsion Funktioniert im Prinzip, aber Problem der Zellgewinnung ungelöst!

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) - die optimale neurale Stammzelle?

Embryonale Stammzelle (ES-Zelle) Most protocols involve ‚embryoid body‘ aggregate culture as initial step and then sequence of different factors

Strategien um spezifische Neuronen aus Stammzellen zu differenzieren (e.g dopaminerge N.) Stem cell Patterning signals Morphogens, Fate specifying transcription factors Select committed progenitors using reporter gene (GFP) Versuch und Irrtum Embryologischer Ansatz Verbesserter Embryolog. Ansatz

Implantation of ES cell-derived differentiated dopaminergic cells into animal model of Parkinson‘s disease Also better in more specific motor tasks

Pax6 Dlx En1/2 Isl1 Lmx Nurr1 Pitx3 Pax6 Nurr1 GABA Nkx2.1 Msx GABA Modified from Marín et al. Dev. Dynamics 234:709-717, 2005

Probleme und Potential von ES Zell-Therapien Undifferenzierte ES Zellen werden zu Teratoma (Tumoren) - 100% der implantierten Zellen müssen differenzierte Neuronen sein. Alternative: Reprogrammierung oder adulte endogene Stammzellen Dopaminerge Neuronen und Motoneuronen aus iPS Zellen, aber auch dort Teratoma-Problem

Wenn differenzierte ES Zellen xenotransplantiert werden (Maus in Ratte) wird eine sehr geringe Tumorrate beobachtet. Sehr hohe Tumorrate bei homologen Transplantationen, selbst wenn die Zellen vor-differenziert wurden (Erdö et al., 2003).

Demyelinisierungs-Erkrankungen (Multiple Sklerose) Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis Nature 422, 688 - 694 (2003);

Radiale Gliazellen produzieren Neuronen in vivo (Cortex) lacZ Glut/NeuN