Klinik und Poliklinik für Urologie der TU Dresden Nachweis von Prostata-spezifischen Transkripten in regionären Lymphknoten von Patienten mit Prostatakarzinom (PCa) Andreas Manseck, Ulrike Fiedler, Romy Kranz, Jana Scholze und Manfred P. Wirth Klinik und Poliklinik für Urologie der TU Dresden Ergebnisse Einleitung Material und Methoden Gegenwärtig können Lymphknotenmetastasen des Prostata-karzinoms (PCa) nur durch die histologische Untersuchung der entnommenen Lymphknoten identifiziert werden. Beim PCa ist der frühzeitige Nachweis von Metastasen jedoch von großer Be-deutung für die adäquate Therapiewahl. Es wird daher nach neuen Methoden zum sensitiveren Nachweis disseminierter Tumorzellen gesucht. Die Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine molekularbiologische Technik mit der die Detektion spezifischer Transkripte möglich ist. Prostatazellen können durch Epithel- oder Prostata-spezifische Marker nachge-wiesen werden. Diese sind z.B. das Prostata-spezifische Antigen (PSA) oder das Prostata-spezifische Membranantigen (PSM). PSM ist ein Transmembran-Glykoprotein, das in der normalen aber auch in der pathologisch veränderten Prostata vorkommt. Neben dem normalen PSM Transkript wurden die PSM‘ und die PSM Variante identifiziert. (Israeli et al., 1993, Su et al., 1995, Bzdega et al., 1997) (Abb. 1). Das Ziel der vorliegenden Studie war die Etablierung von RT-PCRs für PSM und PSM‘. Diese RT-PCRs wurden eingesetzt, um die PSM und PSM‘ Expression in Lymphknoten von PCa Patienten zu untersuchen. Weiterhin sollte überprüft werden, inwieweit PSM- und PSM‘-Transkripte als Marker für die Identifizierung von Lymph-knotenmetastasen geeignet sind. Zellen und Gewebe Die humane Prostatakarzinom Zelllinie LNCaP wurde in RPMI 1640 Medium mit 10% fetalem Kälber Serum und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren kultiviert. Lymphknoten wurden intraoperativ von Patienten erhalten, die sich einer radikalen Prostatektomie unterzogen. Die Lymphknoten wurden halbiert und sowohl histologisch als auch mit PCR-Techniken untersucht. Zusätzlich wurden Lymphknoten von 3 Patienten mit Nierenzellkarzinomen und 2 Patienten ohne Tumorleiden in die Studie aufge-nommen. Die Stabilität der PSM und PSM‘ Transkripte in Lymph-knoten wurde überprüft, indem das Material für 0, 1/2, 1 und 2 Stunden bei Raumtemperatur gelagert wurde. RNA Präparation und RT-PCRs LNCaP RNA wurde mit dem Trizol (LS) Kit von GIBCO BRL isoliert. Lymphknoten wurde unter flüssigem Stickstoff homogenisiert und die RNA Extraktion erfolgte mit dem Trizol (LK) Kit von GIBCO BRL. DNA Kontaminierungen wurde durch DNase I Behandlung eliminiert. Die Qualität der RNA Präparationen wurde durch eine Agarose-Gel Elektrophorese überprüft. RNA wurde mit dem You Prime First Strand Beads-Kit (Pharmacia) und pd(N)6 Hexamer Primern in cDNA umgeschrieben. Folgende PCR’s wurden durchgeführt: Kontroll-PCR mit Nachweis von Transkripten des house keeping Enzyms GAPDH, eine PSM spezifische PCR mit Primern, lokalisiert in den Exonen 1 und 5 und eine PSM‘ spezifische PCR mit Primern in den Exonen 1/2 und 5. (Abb. 2). Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. 1 6 5 4 3 2 7 PSM 2653 bp PSM’ 2387 bp X Abb. 2: RT-PCRs zum Nachweis von PSM, PSM’ und GAPDH Transkripten in LNCaP Zellen. (1: 123 bp DNA Standard, 2-3: PSM und Kontrolle, 4- 5: PSM‘ und Kontrolle, 6-7: GAPDH und Kontrolle). Abb. 1: Struktur der PSM mRNA und der Splice Variante PSM’. Bei PSM’ fehlen die Nukleotide 114-380 in Exon 1. PSM Transkripte wurden mit einem Primer amplifiziert, der in einer Region lokalisiert ist, die in PSM’ fehlt. Für PSM’ RT-PCRs wurde ein Primer eingesetzt, der die Exone 1 und 2 überlappte. Der downstream Primer liegt im Exon 5 (Abb. 1). Der RT-PCR Nachweis von PSM und PSM‘ Transkripten wurde mit LNCaP RNA etabliert (Abb. 2). Die PCR Produkte wurden durch Sequenzierung überprüft Tabelle 1: RT-PCR Ergebnisse: Nachweis von PSM und PSM‘ Transkripten in Lymphknoten. Schlußfolgerungen Wir konnten sensitive RT-PCRs spezifisch für PSM und PSM‘ Transkripte etablieren. (Abb. 2, 3). PSM und PSM‘ Transkripte zeigten eine hohe Stabilität in Lymphkotengewebe. (Abb. 4). PSM Transkripte wurden in nahezu allen Lymphknoten bei Tumor-patienten nachgewiesen. (PCa: 51/54 und RCC: 3/3). PSM scheint daher kein geeigneter Marker für die Entdeckung von PCa Zellen in Lymphknoten zu sein. PSM’ RT-PCRs waren positiv bei 33 von 54 PCa Patienten und zeigten nur schwache Signale bei zwei RCC Patienten. Positive Lymphknoten zeigten im Allgemeinen stärkere PSM‘ RT-PCR Signale als negative Lymphknoten. PCa Patienten mit Gleason 2 oder 3 (n=4) hatten keine PSM’ Signale. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, daß PSM’ möglicherweise ein sensi-tiverer Marker ist als die histologische Untersuchung und eine Quantifizierung der PSM’ Transkripte in Lymphknoten hilfreich bei der Bestimmung des korrekten Tumorstadiums sein könnte. Das Follow-up dieser Patienten mit positiven PSM‘ RT-PCR wird die Relevanz dieses potentiellen neuen Markers zeigen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 Abb. 4: Stabilitätstest für PSM (links) und PSM’ (rechts) Transkripte in tumorpositiven Lymphknoten. (1-4, 8-11: Stabilität nach 0, 1/2, 1, und 2 Stunden, 5: neg. Kontrolle, 6: LNCaP Kontrolle, 7: 123 bp DNA Standard. Abb. 3: Sensitivität von PSM (links) und PSM’ (rechts) RT-PCRs. (1: 100 bp DNA Standard, 2-11 links: 2x1010-2x101 Kopien, 2-7 rechts: 2x105-2 Kopien). Die etablierten RT-PCRs können zwischen 2 bis 20 Transkripte von PSM‘ oder PSM nachweisen (Abb. 3). Nach chirurgischer Entfernung sind PSM und PSM’ Transkripte in Lymphknoten über einen Zeitraum von mindestens 2 Stunden stabil.