Strukturbasiertes phage display

Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Institut für Biotechnologie Arbeitsgruppe Proteintechnologie Ulrike Fiedler Gerald Böhm Rainer Rudolph Carola Reimann

Phage display und panning Selektionsprozess eluierter Phage lösliches Protein

Structure of Antibody Molecules Complete antibody Active site Active site Light chain Heavy chain Intra-chain- disufide bonds Inter-chain disulfide bond IgG molecule Catalytic antibody

Application of Antibodies Diagnostics tumour diagnosis ELISA Therapy cancer Monitoring detection and quantification of bacteria, toxins, viruses, pesticides Purification affinity chromatography bioremediation

Antibodies Advantages Disadvantages Affinity Specificity Size Immunogenicity Low stability

Phagenspezies für das phage display filamentöse Phagen lytische Phagen Expression in der E. coli-Zelle periplasmatisch zytoplasmatisch Plasmamembran äußere Membran

Verwendung von single-chain Fv Antikörpern beim phage display

Anwendungen des phage display-Systems Display natürlicher Peptide: Epitop-Mapping von Antikörpern Herstellung von Immunogenen Display von Random-Peptiden: Epitop-Mapping von Antikörpern Identifizierung von Peptid-Liganden Mapping der Substratbindungsstelle von Proteasen und Kinasen Display von Proteinen und Isolierung von hoch-affinen Antikörpern Protein-Domänen: cDNA Expressions-Screening directed Evolution

Scaffolds für das phage display Cys2His2- Zink-Finger Z-Domäne vom Protein A Tendamistat Cytochrome b562 Zn

Ziel des Projektes Design eines stabilen Proteins mit Bindungseigenschaften Anforderungen an das Scaffold-Protein: - kleines Protein - hohe Stabilität - geringe Immunogenität

Das Augenlinsenprotein Gamma-Kristallin -ein scaffold für das phage display?

Eigenschaften des Gamma-Kristallins sehr stabiles Protein kleines Protein kaum immunogen Kristallstruktur vorhanden 174 Aminosäuren 2 Domänen 4 b-Faltblätter mit jeweils 4 b-Strängen (greek-keay) Gamma-Kristallin als scaffold: stabiles Protein ohne Bindungseigenschaften

Solvent Accessibility 19 17 38 15 2 Accessibility (% of max.) 36 6 4 Residues 1-85 (N-terminal domain)

Sequence Variability “Outside” “Inside”

Mutagenese im b-Faltblatt Mutagenisierte Positionen: Lys 2 Thr 4 Tyr 6 Cys 15 Glu 17 Ser 19 Arg 36 Asp 38 Ser 19 Anzahl der möglichen Varianten: 208 = 2.6 E+10

Ort der Mutagenense Oberfläche des Gamma-Kristallins: 9122 Å2 Mutagenisierter Bereich: 560 Å2 = 6,1%

Konstruktion einer kombinatorischen Gamma-Kristallin-Bank X X X Design der Oligonukleotide Assemblierung Klonierung Expression and Selektion X X X X X X X

Assemblierung der Oligonukleotide Kodon-Nutzung N/N/N - 64 Kodone für eine Aminosäure CAT/N/N - kein Stop-Kodon, kein Cystein, keine aromatischen Aminosäuren N/N/K (T or G) - 32 Kodone für eine Aminosäure Tripletts - 20 Kodone für eine randomisierte Amiosäure Assemblierung an der Festphase SA-coated paramagnetic bead X X X X X X X X X X X X X

Ergebnisse und Probleme Herstellung der Bank Größe der Bank Qualität der eingesetzten Oligo’s Expression der mutierten Proteinen Etablierung des phage display-Systems (scFv) Bildung des Fusionsproteins Display auf dem Phagen Gamma-Kristallin-WT-Protein 3 Stabilität der mutierten Proteine Panning Selektion geeigneter Targets und panning-Bedingungen

Target Molecules Haptens oxazolone, abscisic acid, biotin, digoxigenin, testosterone Proteins BSA, Il4-receptor CEA (carcinoembryonic antigen) tetanus toxoid SH2-domain EGF-receptor Glycoproteins EGP 2 (epithelial glycoprotein)

Erste Zielmoleküle Haptene: Oxazolone Proteine: BSA Biotin Lysozym CD 44 (Oberflächenprotein bei Krebszellen) Enzymatische Glucosidase Aktivitäten:

Weiterführende Arbeiten Gamma-Kristallin-Bänke unter Verwendung von Triplett-Oligonukleotiden Display einzelner Gamma-Kristallin-Domänen oder Gamma-Kristallin-Cystein-Mutanten auf dem Phagen Untersuchung der Wechselwirkungen mit dem BIACORE Stabilitätsuntersuchungen

Ausblick weitere Mutagenesen: loop-Region, Region zwischen N- und C-terminaler Domäne random - DNA-shuffling Fusion der isolierten Kristallin-Mutanten mit dem VP1-Molekül (Targeting Modul) Panning: an lebenden Zellen (zellspezifische Targeting-Module)