Synthetische Biologie und Nanosysteme * ausgewählte Beispiele *

Präsentation zum Thema: "Synthetische Biologie und Nanosysteme * ausgewählte Beispiele *"—  Präsentation transkript:

1 Synthetische Biologie und Nanosysteme * ausgewählte Beispiele *
Vorlesungsreihe "Biophysik der Systeme"

2 Ausrichtung der Forschung
Fortschritte in Sequenzierungstechnik DNA-/Gensynthese Mikrofluidik de novo Design biologischer Systeme Verständnis Anwendung Reduktion der Komplexität Minimale Zelle induzierbare Reaktion chemischer/optischer Stimulus Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren Metabolic Pathway Engineering Synthese/Abbau chemischer Substanzen gerichtete Evolution Protein Engineering Erweiterung des genetischen Codes nicht-natürliche Aminosäuren logische biochemische Netzwerke molekulare Biocomputer selbstorganisierte Strukturen DNA/RNA als Template DNA Maschinen

3 Ausrichtung der Forschung
Fortschritte in Sequenzierungstechnik DNA-/Gensynthese Mikrofluidik de novo Design biologischer Systeme Verständnis Anwendung Reduktion der Komplexität Minimale Zelle induzierbare Reaktion chemischer/optischer Stimulus Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren Metabolic Pathway Engineering Synthese/Abbau chemischer Substanzen Seminar gerichtete Evolution Protein Engineering Erweiterung des genetischen Codes nicht-natürliche Aminosäuren logische biochemische Netzwerke molekulare Biocomputer selbstorganisierte Strukturen DNA/RNA als Template DNA Maschinen

4 bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor
Beispiel 1: Chemotaxis in E. coli bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor Umdesign Signalweg

5 Chemotaxis in E. coli CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY:
Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY: ermöglicht Rotation gegen UZS  Mobilität geradlinige Fortbewegung Taumeln WT DCheZ

6 Chemotaxis in E. coli Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) Riboswitches kontrollieren die Genexpression abhängig von Liganden

7 Chemotaxis in E. coli DCheZ kombiniert mit Riboswitch:
Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) DCheZ kombiniert mit Riboswitch:  Mobilität abhängig von Ligandenkonzentration

8 Chemotaxis in E. coli konzentrationsabhängige Mobilität
Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) konzentrationsabhängige Mobilität  Migration entlang Gradienten zu höherer Konzentration ("Pseudotaxis")

9 bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor
Beispiel 2: Lichtgesteuerte Expression in E. coli bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor Neudesign Rezeptor

10 Lichtgesteuerte Expression in E. coli
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005) Phytochrom: Chimäre aus 2 Modulen - extrazellulärer Photorezeptor (Cph1 aus Cyano-Bakterium Synechocystis) intrazellulärer Regulator (EnvZ aus E. coli, zuständig für osmotische Regulation) Transformation in DEnvZ E. coli für die Synthese von PCB in E. coli: ho1 und pcyA Gene aus Synechocystis Cph1 EnvZ on off

11 Lichtgesteuerte Expression in E. coli
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005) Selektion Chimäre Cph8 mit hohem hell-dunkel "Kontrast" +EnvZ Belichtungszeit: 4h bei 37°C

12 Lichtgesteuerte Expression in E. coli
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)  räumliche Kontrolle der Genexpression  Auflösung: 108 Bakterien (Pixel) pro square inch

13 Beispiel 3: Gerichtete Evolution
Mutation Selektionsdruck verbesserte Variante Ausgangsprotein bestehendes Protein veränderte Funktionalität

14 Gerichtete Evolution Erzeugung der Bibliothek (107-1010)
- Mutagenese einer Oligonukleotid-Kassette fehleranfällige PCR Umklonierung in Plasmid und Transformation z.B. in E. coli  Genpool Kopplung von Phenotyp und Genotyp Affinität: Phage display oder Yeast cell display Funktionalität: E. coli, in vitro Kompartimentisierung Antigen Selektion und Screening Affinität: über Antigen Funktionalität: FACS (fluorescent activated cell sorting)

15 Gerichtete Evolution in vitro Kompartimentisierung:
Wasser-in-Öl-(in-Wasser) Emulsionen kleine Reaktionsvolumina: hohe Konzentration, schnelle Kinetik 1010 pro ml: hoher Durchsatz Selektionsdruck frei wählbar kompatibel mit Mikrofluidik, FACS: 107 pro h Mastrobattista et al., Chem. Biol. 12: 1291 (2005)

16 Gerichtete Evolution: Anwendungen
typischerweise 6-12 Runden Biokatalysatoren - veränderte Substratspezifität veränderte/verbesserte Enantioselektivität - erhöhte Aktivität (50x) in unnatürlichem Reaktionsmilieu - erhöhte Thermostabilität (+15°C) Antikörper Affinitätssteigerung x Affinität für neues Antigen: x schlechter als in der Natur

17 Beispiel 4: Erweiterung des genetischen Codes
Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in Proteine

18 Erweiterung des genetischen Codes
stellenspezifisch, cotranslational anstatt der natürlichen AS Standard-Code

19 Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren
Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006) Anforderungen: orthogonales tRNA-Codon Paar orthogonale aminoacyl-tRNA-Synthetase nnAS im Cytosol

20 Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren
Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006) amber stop codon (UAG) supression orthogonales tyrosyl-tRNA/tyrosyl-RS Paar aus Methanococcus janaschii gerichtete Evolution der tRNA in E. coli mit negativ/positiv-Selektion gerichtete Evolution der Substratspezifität der RS negativ: Orthogonalität zu endogenen Synthetasen (sonst Zelltot durch Expression von Barnase) orthogonal oder nicht funktionell positiv: mit Synthetase (Expression sonst Zelltot)  Orthogonal + Funktionell ins Translation

21 ? Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren
Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006) ? Fluorescein

22 Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen
Beispiel 5: DNA Computing Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen mithilfe von DNA Sequenzen

23 DNA Computing Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph
Adleman, Science 266: 1021 (1994) Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph Existiert ein Weg von 0 nach 6, der alle Knoten genau einmal durchläuft?

24 DNA Computing Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph
Adleman, Science 266: 1021 (1994) Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph Algorithmus 1. Generation zufälliger Wege 2. Auswahl Pfade von 0 nach n 3. Auswahl Pfade mit n Knoten 4. Auswahl Pfade, die alle Knoten durchlaufen 5. "wahr" / "falsch"

25 DNA Computing Knoten und Kanten 20mer DNA
Adleman, Science 266: 1021 (1994) 2 1 3 Knoten und Kanten 20mer DNA Algorithmus 1. Ligation 2. PCR mit Primer O0 und O6 3. Agarose-Gel: Bande mit 140bp 4. Affinitätsselektion von ssDNA mit O1,…,O5 5. Probe: PCR mit O0 / O1, O0 / O2,…, O0 / O6

26 Logische biochemische Netzwerke
Seelig et al., Science 314: 1585 (2006) boolsche Logik "0": niedrige Konzentration "1": hohe Konzentration in out AND

27 Logische biochemische Netzwerke
Seelig et al., Science 314: 1585 (2006)

28 Logische biochemische Netzwerke
Zhang et al., Science 318: 1121 (2007) Signalverstärkung - kinetisch inhibiert (Zeitskala Experiment) - Katalysator (Input) beschleunigt Reaktion um 104 - Entropie-getrieben

29 Beispiel 6: DNA Maschinen
Spielerei?

30 DNA Maschinen DNA-Läufer entlang DNA-Schiene Unidirektionalität durch
Treibstoff Restriktionsenzym Treibstoff Abfall Bath & Turberfield, Nat. Nanotech. 2: 275 (2007) Yin et al., Nature 451: 318 (2008) Unidirektionalität durch Zugabe der Treibstoffstränge in definierter Reihenfolge Zerstörung der Schiene Passivierung der Schiene durch Treibstoffstränge