Praktikum: Nachweis einer gentechnischen Veränderung in Lebensmitteln durch PCR

Vorbereitung Lehrer Für jede Arbeitsgruppe werden 550 µl InstaGene-Matrix aliquotiert! Das Tube wird mit „IG“ beschriftet! Vorbereitung Lehrer

DNA-Extraktion 1. Vorbereitung 1.1 Beschriften Sie 2 Schraub- tubes mit: - non GMO (-GMO) - Lebensmittelprobe (T) und Ihrer Gruppennummer!

DNA-Extraktion 1.2 Pipettieren Sie jeweils 250 μl der durch Auf- und Abpipettieren homogenisierten InstaGene-Matrix aus Ihrem Vorratstube („IG“ mit 550 µl Gesamtvolumen) in die beiden beschrifteten Tubes! Überstand Beide Tubes sollten etwa die gleiche Menge InstaGene-Perlen enthalten!

DNA-Extraktion 2. DNA-Extraktion aus „nicht GV- Lebensmitteln (-GMO)“ 2.1 Wiegen Sie 1 g des nicht gen- technisch veränderten Lebens- mittels (-GMO) ab und geben Sie es in einen Mörser! 2.2 Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!

DNA-Extraktion 2.3 Homogenisieren Sie das Gemisch etwa 5 Minuten! 2.4 Pipettieren Sie weitere 5 ml H2Odest. hinzu und zermörsern Sie weiter, bis ein pipettierbarer Brei entstanden ist!

DNA-Extraktion 2.5 Pipettieren Sie 25 μl des Lebens- mittelbreis in das mit „-GMO“ beschriftete Schraubtube (Inhalt des Schraubtubes 250 µl InstaGene)! 2.6 Verschließen Sie das Tube und durchmischen Sie durch Anschnippen!

Um Kontamination mit +GMO-DNA zu vermeiden, wurde zuerst das -GMO-Material extrahiert! Die Reinigung von Mörser und Pistill erfolgt mit einem Detergenz z.B. „Pril“. Danach wird mit H2Odest. nachgespült.

3. DNA-Extraktion aus zu testendem Lebensmittel (T) 3.1 Wiegen Sie 1 g des zu testenden Lebensmittels (T) ab und geben Sie es in einen Mörser! 3.2 Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!

DNA-Extraktion 3.3 Homogenisieren Sie das Gemisch etwa 5 Minuten! 3.4 Pipettieren Sie weitere 5 ml H2Odest. hinzu und zermörsern Sie weiter, bis ein pipettierbarer Brei entstanden ist!

DNA-Extraktion 3.5 Pipettieren Sie 25 μl des Lebensmittelbreis in das mit ("T") beschriftete Schraubtube (dieses enthält bereits 250 µl InstaGene)! 3.6 Verschließen Sie das Tube und durch- mischen Sie durch Anschnippen!

Reinigen Sie den Mörser und Pistill mit einem Detergenz! Reinigung Reinigen Sie den Mörser und Pistill mit einem Detergenz!

4. Enzymdenaturierung bei 95°C DNA-Extraktion 4. Enzymdenaturierung bei 95°C 4.1 Inkubieren Sie die beiden Schraubtubes 5 Minuten bei 95°C im Wasserbad! 4.2 Zentrifugieren Sie die Tubes 5 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute! 95oC

Beachten Sie: Bei der Entnahme der Kontroll-DNA (-GMO) und der DNA der Lebensmittelproben (T) aus den Schraubtubes darf nur der Überstand ohne InstaGene- Perlen entnommen werden!

Bedeutung der InstaGene-Matrix InstaGene-Matrix ist negativ geladen  bindet vorhandene Kationen  Kationen dienen als Cofaktoren von Enzymen, wie z. B. der DNasen  DNasen werden nicht aktiviert  DNA-Abbau wird verhindert Aber: InstaGene-Matrix bindet Mg2+-Ionen und hemmt damit die Polymerase bei der PCR

Aufbewahrung der Proben Die Tubes können im Kühlschrank (bei 8oC mit der Matrix) über Tage aufbewahrt werden!

Entnahme des Überstandes DNA-Extraktion Entnahme des Überstandes 4.3 Überführen Sie jeweils 50 µl des Überstandes aus Ihren Tubes in zwei neue, zuvor entsprechend beschriftete Tubes (–GMO, T)!

Ansetzen des PCR-Master-Mix Zu beachten ist: Gebrauchsfertiges Gemisch aus PCR-Master-Mix mit Primern darf bis zum Start der PCR nicht länger als 30 Min. auf Eis stehen! Innerhalb dieser 30 Min. müssen alle Proben für die PCR angesetzt sein! Eis richten!

Achtung!!! Nach dem Auftauen: der Taq-Polymerase und des Master Mix die Tubes vor dem Öffnen zentrifugieren!

Zusammensetzung PCR-Master-Mix 100 mM KCl 20 mM Tris-HCl 2 mM dNTP (ATP, GTP, CTP, TTP) 4 mM MgCl2 1 µM Primer 0.35 µl Taq-Polymerase

Ansetzen des Molekulargewichts-Standards durch den Lehrer Pipettieren Sie 30 µl Orange-D-Loading-Dye zum Molekulargewichts-Standard! Tube auf Eis stellen!

Aliquotieren des PCR-Master-Mix durch den Lehrer Jeweils 300 µl PCR-Master-Mix werden zu den Plant Primern (6 µl) und GMO Primern (6 µl) pipettiert! Tubes auf Eis stellen!

Vorbereitung: PCR und Elektrophorese in Gruppenarbeit (20`) Jede Arbeitsgruppe bereitet für alle weiteren Gruppen entsprechend Ihrem Arbeitsauftrag einen Teil der PCR oder der Elektrophorese vor. Arbeits- aufträge

Tubes pro Arbeitsgruppe nach der Gruppenarbeit +GVO -GVL T GMM PMM LD MWR 6 PCR-Tubes

Ansetzen und Durchführung der PCR (200`) Nummerierung der PCR-Tubes 1.1 Nummerieren Sie Ihre PCR-Tubes 1 - 6!

1.2 Pipettieren Sie die PCR-Ansätze nach folgender Tabelle! Nr. Master Mix DNA 1 2 10 µl PMM 10 µl GMM 10 µl –GVL (Kontrolle) 3 4 10 µl Lebensmittelprobe (T) 5 6 10 µl +GVL (Kontrolle) MM: Mastermix; GVL: gentechnisch verändertes Lebensmittel

Ansetzen und Durchführung der PCR 1.3 Durchmischen Sie ihre PCR-Ansätze durch Auf- und Abpipettieren! Zentrifugieren Sie Ihre PCR-Ansätze falls notwendig 1 Minute bei 1000 Umdrehungen! 1.4 Kühlen Sie Ihre PCR-Ansätze im Eis bis zum Beginn der PCR!

Ansetzen und Durchführung der PCR - Um Verwechslungen zu vermeiden tragen Sie die Position Ihrer Proben im Thermocycler auf dem Übersichtsblatt ein! Über- sichts- blatt - Tubes müssen gut verschlossen sein!

Ansetzen und Durchführung der PCR Führen Sie die PCR entsprechend dem Temperaturprogramm am Thermocycler durch! Cycler- Programm

DNA-Amplifikation Cycler-Programmierung 40 Zyklen 60``, 94 °C Denaturation 120``, 94°C Denaturation 40 Zyklen 60``, 59 °C Annealing 10`, 72 °C Completing 120``, 72 °C Elongation

Durchführen der PCR 40 Zyklen: Cycler-Programmierung: Denaturieren 94 oC 2 Min. 40 Zyklen: Denaturieren 94 oC 1 Min. Primeranlagerung 59 oC 1 Min. DNA-Neusynthese 72 oC 2 Min. Vervollständigung der neuen Stränge: 72 oC 10 Min. Dauer: ca. 3 Stunden

Ende der PCR Nach der Amplifizierung können die Proben bei – 20oC im Eisfach oder über Nacht bei 4oC im Cycler bis zur Gelelektrophorese aufbewahrt werden.

Nachweis der PCR–Produkte durch Elektrophorese (Agarose/PAGE) Führen Sie den Nachweis der PCR-Produkte entsprechend Ihres Arbeitsauftrages als Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch! Färben Sie Ihre Gele entsprechend Ihres Arbeits-auftrages und werten Sie diese aus! Arbeitsgruppe 1 - 4 Arbeitsgruppe 5 - 8 Agarose- Gelelektro- phorese PAGE Befüllen des Gels