Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae

Präsentation zum Thema: "Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae"—  Präsentation transkript:

1 Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae
Zellfraktionierung Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

2 Durchführung Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien
Ernten Aufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch Isolierung + Reinigung der Fraktionen Mitochondrien Mikrosomen Proteinbestimmung nach Lowry Markerenzymmessungen NADPH-Cytochrom c-Reduktase (Mikrosomen) Succinatdehydrogenase (Mitochondrien) Quantitative Bestimmung der Cytochromen Cytochrome c-Reduktase spez. Für die Mikrosomen, nicht für Mitochondrien, auch wenn Cytochrome in der oxidativen Phosphorylierung!! Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

3 Reagentien Puffer A (Dithiothreitol)
Di-Sulfidbrücken werden dadurch aufgebrochen (Vorbereitung für Zymolyasezugabe) Puffer B ( Sorbit) & Puffer C ( Mannit) Damit der osmotische Druck stabil bleibt Zymolyase Enzym zum Abbau von Zellmembran Phenylmethylsulfonylfluorid Inhibiert proteolytische Abbaureaktionen Triton X-100 Detergenz löst Membranlipide Phenanzinmethosulfat Mediator zur Wasserstoffübertragung, verstärkt die Reaktion Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

4 Aktivitätsmessung Messung durch
Aktivitätsenzym, welches nur in spezifischen Organell einer Zelle eine Reaktion hervorruft Immunologische Charakterisierung Identifizierung von Zellfraktionen durch charakteristische Proteine mittels Elektrophorese Elektronenmikroskopie, Bestimmte Strukturen und Dichte sind spezifisch für das jeweilige Organell. Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

5 Unterschiede der Nährmedien
Lactat Glucose Aerob Citratzyklus + Oxidative Phosphorylierung Mitochondrien Bis zu 12 ATP / Lactat Niedrigere Zellausbeute zu erwarten Anaerob, aber auch unter aeroben Bedingungen Glycolyse + Fermentation zur Energiegewinnung bevorzugt Cytosol 2 ATP / Glucose Pasteur-Effekt Crabtree-Effekt Höhere Zellausbeute zu erwarten Glykolyse + Fermentation: viel einfacherer, kürzerer Stoffwechselweg, deshalb auch unter aeroben Bedingungen bevorzugt (=Crabtree-Effekt) Cytochrom b2- Lactat zu Pyruvat Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

6 Citratcyclus & Fermentation im Vergleich
Lactat -> Pyruvat liefert keine Energie, deshalb erfolgt keine Fermentation sondern eine aerobe Verstoffwechselung durch den Citratzyklus 1 Lactat liefert 1 Pyruvat deshalb ATP Gewinn halbiert in weiterer Folge … Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

7 Citratcyclus & Fermentation im Vergleich 2
Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit Cytochrom b2 Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

8 Unterschiede im Zellaufbau
Lactat Glucose Atmungskette findet in den Mitochondrien statt- dadurch vermehrte Mitochondrien- Bildung Höherer Anteil an ß-1,6-Glucan (verursacht langsameren Verdau) in der Zellwand 50 min. bei 30°C mit Zymolyase Fermentation findet im Endoplasmatischen Reticulum statt- dadurch vermehrte Mikrosomen-Bildung Niedrigerer Anteil an ß-1,6-Glucan 30 min. bei 30°C mit halber Zymolyase-Menge Laut einer Studie von B. Aguilar-Uscanga und J.M. Francois nimmt die Resistenz der Zellwand gegen den Abbau durch Zymolyase mit steigendem ß-1,6-Glucan-Gehalt zu. Des Weiteren haben ihre Untersuchungen ergeben, dass der Anteil an ß-1,6-Glucan in der Zellwand stark von der zur Züchtung verwendeten Kohlenstoffquelle abhängt. Während dieser in den auf Glucose gezüchteten Quellen nur ca. 14% beträgt, steigt der Gehalt bei Verwendung von GaLactat auf 19% und bei Ethanol als Kohlenstoffquelle sogar auf 21%, was zu einem entsprechend langsameren Abbau der Zellwand führt (4-mal langsamer bei GaLactat als C-Quelle) . Vgl. B. Aguilar-Uscanga und J.M. Francois; Letters in Applied Microbiology 2003, 37, 268–274 Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

9 Proteinbestimmung nach Lowry
Ablesen der Proteinmenge in der Messküvette aus gegebener Kalibrationskurve (c[µg/2,6mL] gegen Absorption) Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

10 Markerenzymbestimmung
Benötigte Werte: Aktivität ([ΔE/min], entspricht der Steigung), in dem Bereich, in dem die Steigung maximal ist!- umrechnen in Minuten Volumen der Organellenfraktionen Proteinkonzentration in der jeweiligen Fraktion Ist ein Diagramm der NADPH-Cytochrom c-Reduktase- für die Succinatdehydrogenase äquivalent Wie genau- Tafel, aber ganz genau ist nicht soo wichtig Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

11 Markerenzyme- Aktivitätsberechnungen
Spezifische Aktivität [(ΔE/min)/mg] 𝑠𝑝𝑒𝑧. 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝛥𝐸 𝑚𝑖𝑛∗𝑚𝑔 = 𝑆𝑡𝑒𝑖𝑔𝑢𝑛𝑔 𝑘 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑖𝑛 𝑑𝑒𝑟 𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒 Gesamtaktivität der Fraktion [ΔE/min] 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝛥𝐸 𝑚𝑖𝑛 =𝑠𝑝𝑒𝑧 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡∗ 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒ℎ𝑎𝑙𝑡 𝐹𝑟𝑎𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛 (𝑜𝑑𝑒𝑟 𝐻𝑜𝑚𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑡) Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

12 Markerenzyme- Reinheitsbestimmung
Ausbeute 𝐴𝑢𝑠𝑏𝑒𝑢𝑡𝑒 % (𝑎𝑢𝑓 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑏𝑎𝑠𝑖𝑠)= 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒ℎ𝑎𝑙𝑡 𝐹𝑟𝑎𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛∗100 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒ℎ𝑎𝑙𝑡 𝐻𝑜𝑚𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑡 𝐴𝑢𝑠𝑏𝑒𝑢𝑡𝑒 % (𝑎𝑢𝑓𝑀𝑎𝑟𝑘𝑒𝑟𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑏𝑎𝑠𝑖𝑠)= 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝐹𝑟𝑎𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛∗100 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝐻𝑜𝑚𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑡 Anreicherungsfaktor 𝐴𝑛𝑟𝑒𝑖𝑐ℎ𝑒𝑟𝑢𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟= 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝐹𝑟𝑎𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛∗100 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝐻𝑜𝑚𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑡 Kreuzkontamination 𝐾𝑟𝑒𝑢𝑧𝑘𝑜𝑛𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 % = 𝑆𝑝𝑒𝑧. 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝑑𝑒𝑟 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑖𝑒𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑛 𝐹𝑟𝑎𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛∗100 𝑆𝑝𝑒𝑧. 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 𝑑𝑒𝑟 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑖𝑒𝑟𝑡𝑒𝑛 𝐹𝑟𝑎𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛 Warum auf Markerenzymbasis notwendig?- weil Ausbeute auf Proteinbasis die Gesamtheit aller Proteine erfasst, und nicht das spezifische Markerenzym !!! Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

13 Quantitative Cytochrombestimmung
Mittels Lambert-beer‘schem Gesetz Wellenlängenpaar λBasis/λMax zur Bestimmung von ΔE Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

14 Cytochrom- Berechnung
Bestimmung erfolgt über Differenzspektrum der α-Banden 𝑐= 𝛥𝐸 𝜀∗𝑑 ΔE…Extinktionsunterschied zw. λmax und λBasis ε Proteinkonzentration[mg/ml] Eλmax,α Ebasis ΔE c (Messlsg.) [mmol/l] c (Mit.-Susp.) [nmol/mg] Cytochrom aa3 24 3,659 0,012794 -0,00115 0,0139 5,810E-04 0,1588 Cytochrom b 25,5 3,694 0,076551 0,047876 0,0287 1,125E-03 0,3044 Cytochrom c+c1 19,2 0,088646 0,018298 0,0703 3,664E-03 1,0015 Inkl. Aller Verdünnungs-/ und Umrechnungsfaktor Verdünnungen: c0 (Mit.-Suspension) = 3,967 mg/ml V(Suspension) = 2120 µL V(Cholat) = 111,58 µL c(Protein) = 3,768 mg/mL V(Protein-Dispersion) = 1 mL V(Messlösung) = 1030µL (10 µl K3[Fe(CN)6], 10 µl KCN, bei a und c noch 10 µl Natriumascorbat/TMPD, bei b festes Natriumdithionit) c [nmol/mg] = c [mmol/ml] / Proteinkonzentration [mg/ml] Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

15 Nicht vergessen! Verdünnungen beachten Einheiten Taschenrechner
Schummelzettel  Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

16 Danke für die Aufmerksamkeit
Fragen? Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch