Bluttests - Alternativen zu Stuhltests ? Matthias P. Ebert II. Medizinische Klinik und Roman-Herzog-Krebszentrum Klinikum rechts der Isar TU München 1

Darmkrebsdiagnostik Molekulare Stuhltests Molekulare Bluttests

Adenom - Karzinom - Sequenz Nachweis möglich ?

Knudson’s Doppel Hit Hypothese Normal Tumor Normal Tumor sporadisch hereditär Mutation Methylierung Ebert M and Opitz O, Gastroenterology 2009

Zwei Hauptkomponenten des epigenetischen Codes Methyl Histone Zwei Hauptkomponenten des epigenetischen Codes DNA Methylierung Histonmodifikationen aus Qiu, Nature 2006; 441, 143-145

DNA Methylierung und Karzinogenese

DNA Methylierung und Karzinogenese DNMT Normal Exon Exon Exon Exon DNMT Tumor Unmethyliertes Cytosin Methyliertes Cytosin aus Munten, Am J Pathol 2009

Mutation Methylierung

Darmkrebsdiagnostik Molekulare Stuhltests Molekulare Bluttests

Tumor DNA im Blut Tumor DNA ins Blut abgegeben mit DNA Konzentrationen z.T. < 5 pg/ml (weniger 2 Genomkopien) Gesunde „Hintergrund“ DNA im Blut bei etwa 10 ng/ml Wenn man davon ausgeht, dass die DNA im Plasma von Tumorpatienten und auch von Gesunden aus Zellen des Körpers stammt, die durch apoptotischen und/oder nekrotischen Zelltod zugrunde gehen, ist es eigentlich ungewöhnlich, Teile dieser zellulären DNA im Blutplasma wiederzufinden. Denn aus Gründen der Gefahr von lokalen Entzündungen und Autoimmunreaktionen wird die DNA aus solchen sterbenden Zellen gewöhnlich von Phagozyten aufgenommen und versorgt. Der Inhalt von Zellen, die apoptotisch zugrunde gehen, wird in apoptotische Vesikel verpackt, die dann von den Makrophagen aufgenommen und abgebaut werden (Savill, 1998; Ren und Savill, 1998). Auch der Zellinhalt nekrotischer Zellen wird von den Phagozyten entsorgt und beseitigt (Green und Beere, 2000). Es kann sein, dass –insbesondere an Orten mit hoher Gewebsdestruktion – die Phagozyten nicht in der Lage sind, sämtliche Bestandteile der sterbenden Zellen aufzunehmen, und ein Teil der DNA so die Möglichkeit hat, in die Blutzirkulation zu gelangen. Ein weiterer Punkt, der eigentlich gegen eine Anwesenheit von DNA im Blutplasma spricht, ist die Anwesenheit von DNasen, die die DNA abbauen und katabolisieren (Napirei et al., 2000).Allerdings konnten einige Untersuchungen zeigen, dass die DNA aus apoptotischen und nekrotischen Zellen sofort mit einem Schutzprotein umgeben wird, dem SAP-Protein (Serumamyloid P component). SAP ist ein konstitutiv exprimiertes, hoch konserviertes Plasmaprotein, das mit etwa 30 mg/l Plasma im Plasma vorkommt (Pepys und Butler, 1987) und zur Familie der Pentraxine gehört. Es wurde gezeigt, dass SAP kalziumabhängig an DNA, Chromatin und Nukleosomen-Core-Partikel bindet (Pepys und Butler, 1987) und durch diese Bindung die H1-Histone verdrängt (Butler et al., 1990). Durch diese Bindung wird langes natives Chromatin löslich, das in den physiologischen Bedingungen der extrazellulären Flüssigkeiten unlöslich ist(Butler et al., 1990). Zudem weiß man, daß SAP in vivo an die Vesikel apoptotischer Zellen und an Zellkernstücke aus nekrotischen Zellen bindet (Breathnach et al., 1989). Untersuchungen an SAP-knockout-Mäusen zeigen, dass SAP in vitro und in vivo eine verlangsamte, kontrollierte Chromatin-Degradation bewirkt und somit Autoimmunerkrankungen durch freies Chromatin verhindert. Mäuse ohne SAP entwickeln eine Autoimmunerkrankung, die dem menschlichen SLE (systemischer Lupus Erythematodes) sehr ähnlich ist: einer Autoimmunerkrankung, die durch die Anwesenheit von Autoantikörpern gegen DNA und Chromatin gekennzeichnet ist (Bickerstaff et al., 1999). Die Hauptfunktion von SAP ist also die Bindung an freie DNA oder freies Chromatin im Plasma und die dadurch vermittelte Interaktion mit Komplementkomponenten (Hicks et al., 1992), die zur Clearance der DNA bzw. des Chromatins führen (Paul und Carroll, 1999). Bisher wurde eine Bindung von SAP an die Plasma-DNA nicht nachgewiesen, aber da die DNA offensichtlich nur langsam abgebaut wird und im Plasma nicht immunogen wirkt, ist dies höchst wahrscheinlich. Simplified illustration of different sources to detect tumor-specific methylated DNA. Normal epithelial cells (N) have unmethylated CpG islands, whereas preneoplastic cells (PN) can develop methylation of certain CpG islands. These methylation changes can be enhanced toward genesis of carcinoma in situ (CIS) and invasive cancer (IC). Depending on the site and stage of the tumor or the noninvasive lesion, methylated DNA can be studied either in the blood or in samples drained either physiologically or artificially to the outside of the body. Als Carcinoma in situ (CIS) (wörtlich: "Krebs an Ort und Stelle") wird ein Frühstadium eines epithelialen Tumors ohne invasives Tumorwachstum bezeichnet, welcher ausschließlich intraepithelial wächst, z.B. in der obersten Haut- oder Schleimhautschicht oder in den Milchgängen der Brustdrüse. Wenn Tumoren wachsen, können sie das gesunde Nachbargewebe verdrängen ohne es zu zerstören oder aber zerstörend in das Nachbargewebe einwachsen (invasiv-destruierendes Wachstum). Widschwendter M, Clin Cancer Res 2006

Nachweis von Methylierung im Plasma C. Lofton-Day, Clin Chem 2008

Training/Testing Study 2008 (n = 269) Fall-Kontroll-Studien: Sept9 Septin9 Test Training/Testing Study 2008 (n = 269) CE Study 2009 (n = 257) PRESEPT Study 2010 (n = 1511) All Studies Design case control prospective accumulated Patient Stage positive/ tested % positive I 19 / 41 46 25 / 44 57 8 / 22 36 49 II 60 / 78 77 19 / 22 86 8 / 14 76 III 47 / 61 17 / 28 61 7 / 12 58 70 IV 7 / 7 100 8 / 9 89 4 / 5 80 90 All 133 / 187 71 69 / 103 67 27/ 53 51 Controls 29 / 327 9 (91) 17 / 155 11 (89) 126/1458 14

Prospective clinical validation of an assay for methylated Septin 9 DNA in human plasma as a colorectal cancer screening tool in average risk men and women 50 years and older Timothy R. Church, Michael Wandell, Catherine Lofton-Day, Steven J. Mongin, Brent A. Blumenstein, John I. Allen, Thomas Roesch, Neal Osborn, Dale Snover, Robert Day, and David F. Ransohoff for the PRESEPT Clinical Study Steering Committee, Investigators, and Study Team

PRESEPT: Patienten Anzahl der Studienzentren: 32 Zentren Deutschland: 10 Zentren USA: 22 Patienten eingeschlossen: 7,929 Ausgeschlossene Patienten (z.B. Diagnose unvollständig, Koloskopie inkomplett, Blutprobe nicht verwendbar): 813 Zustimmung zurückgezogen: 9 Diagnose: anderes Malignom: 6 Verfügbar für molekulare Analyse: 7,107 KRK identifiziert: 53 Mehr als 2/3 der 53 KRK in frühen Stadien (I und II) und viele Stadium I Karzinome waren pT1 Tumoren 16

PRESEPT Studie: Ergebnisse Spezifität 91% Sensitivität 51% Hohe Rate von frühen Tumorstadien (Screening-Population) Geringe Gesamtzahl von Tumoren (grosses Konfidenzintervall) n = 53 n = 1458 17

Training/Testing Study 2008 (n = 269) Comparison of PRESEPT and Previous Case Control Study Results Septin9 Test Training/Testing Study 2008 (n = 269) CE Study 2009 (n = 257) PRESEPT Study 2010 (n = 1511) All Studies Design case control prospective accumulated Patient Stage positive/ tested % positive I 19 / 41 46 25 / 44 57 8 / 22 36 49 II 60 / 78 77 19 / 22 86 8 / 14 76 III 47 / 61 17 / 28 61 7 / 12 58 70 IV 7 / 7 100 8 / 9 89 4 / 5 80 90 All 133 / 187 71 69 / 103 67 27/ 53 51 Controls 29 / 327 9 (91) 17 / 155 11 (89) 126/1458 18

PRESEPT Studie: Schlussfolgerung mSEPT9 Biomarker im Rahmen einer prospektiven Studie erfolgreich validiert >50% Sensitivität (entspricht Vorgaben der Amerikanischen Krebsgesellschaft) >85-90% Spezifität Sensitivität Spezifität PRESEPT (2-PCR replicate) 51% [37.7% – 64.2%] 91% [89.9 – 92.8] PRESEPT (3-PCR replicate) 67% [53.8% – 78.8%] 88% [86.8% - 90.1%] The Instruction for Use of the CE market Ep proColon test will NOT change. The US product will be developed as an improved version of the CE marked product. 19

Molekularer Nachweis von Adenomen Neue Strategie ? Molekularer Nachweis von Adenomen

Gewebe Cancer Res 2009 tissue factor pathway inhibitor 2

ALX4 Methylierung im Adenom Ebert et al, Gastroenterology 2006

ALX4 Methylierung beim KRK: Plasma 20 40 60 80 100 AUC=0.839 p<0.0001 x102 pg/ml 5 4 3 2 1 Sensitivität Spezifität 0.03 pg/ml 90% 53.3% 41.4 pg/ml 83% 70% Normal Cancer (n=30) (n=30) Ebert et al, Gastroenterology 2006

ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome Polypen: n=49 > 1cm Polyp mit aIEN n=7 Tubulovillöses Adenom-2 Tubulares Adenom-5 > 1 cm Adenom, ohne aIEN n=9 < 1 cm Adenom, ohne aIEN n=17 < 1 cm Adenom, mit aIEN-3 (alle tubulovillös) Hyperplastische Polypen n=13 <1 cm-11 >1 cm-2 CRC: n=5 Stadium I-4 Stadium III-1 Negativ: n=22

ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome Polypen Zahl der Proben SEPT9 2/3 ALX4 2/3 SEPT9 or ALX4 2/3 SEPT9 + ALX4 3/6 # % > oder = 1 cm 18 3 17 10 55 13$,* 72 12* 67 < 1 cm 31 13 42 13* 39 Hyperplastisch 1 8 6 46 6x 4x Tubuläres oder tubulovillöses Adenom-alle Grössen 36 5 14 47 20§ 20* Tubuläres oder tubulovillöses Adenom, > 1cm 16 19 50 11§ 69 11* Tubuläres oder tubulovillöses, >1cm + aIEN 7 4 57 6§ 86 6* Normale Kontrollen 22 4.5 2 9 Tanzer et al, Plos One 2010

ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome Polypen Zahl der Proben SEPT9 2/3 ALX4 2/3 SEPT9 or ALX4 2/3 SEPT9 + ALX4 3/6 # % > oder = 1 cm 18 3 17 10 55 13$,* 72 12* 67 < 1 cm 31 13 42 13* 39 Hyperplastisch 1 8 6 46 6x 4x Tubuläres oder tubulovillöses Adenom-alle Grössen 36 5 14 47 20§ 20* Tubuläres oder tubulovillöses Adenom, > 1cm 16 19 50 11§ 69 11* Tubuläres oder tubulovillöses, >1cm + aIEN 7 4 57 6§ 86 6* Normale Kontrollen 22 4.5 2 9

Erlaubt die Bestimmung von epigenetischen EPITEK - Projekt Fragestellung Erlaubt die Bestimmung von epigenetischen Markern im Blut die Prädiktion von Vorläuferläsionen des kolorektalen Karzinoms ?

EPITEK – Studie (Epigenetischer Screening-Test für Kolorektale Adenome) 2000 Vorsorgekoloskopien mMARKER Adenome

Marker Daten Proben EPITEK Epigenomics Biomarkeridentifizierung Assay Entwicklung Marker KVB Koordination Gastro-Partner Dokumentation Befunde Prof. M. Ebert/TUM Probenaufarbeitung und -Sammlung Assays Study Office Daten Proben

3 Phasen der EPITEK Studie Marker Selektion Studie I EPITEK Studie 3-4 Marker 2 Marker 20 Marker 2 Marker 2000 Blut Gewebe 300 40 nach Darmspiegelung vor Darmspiegelung 2009 2010 2011 www.myepitek.de

Bluttests als potente Alternativen zu Stuhltests ? Der molekulare Nachweis genetischer und epigenetischer Veränderungen im Stuhl und Blut ist geeignet Kolonkarzinome nachzuweisen Die meisten Veränderungen wurden bislang in kleinen und retrospektive Serien untersucht Erstmalig Validierung eines Tests in einer prospektiven Studie (Sept9) Wissenschaftliche Studien befassen sich zukünftig mit der nichtinvasiven Detektion von Vorläuferläsionen (EPITEK)