Praktikum Molekularbiologie Klonierungsvektor DNA-Sequenzierung: Sanger DNA-Sequenzierung: next generation

Klonierungsvektor

Ligation PCR-Produkt Re-Ligation des Vektors Plasmid-Vektor Ligase (zukünftiges Insert) Re-Ligation des Vektors Plasmid-Vektor (pDrive, Qiagen; pBluescript, Stratagene; pGEM, Promega) Ligase Zirkuläres PCR-Produkt Vektor + Insert

Transformation +   E. coli Transformation Wachstum auf LB-AXI ? PCR-Produkt Plasmid + E. coli Transformation Wachstum auf LB-AXI ? ? ? ? ? - -  

pDrive Klonierungsstelle

Blau/Weiß Selektion Klonierungsstelle pDrive oder pBluescript lacZ‘ Ligation Genexpression β -Galacxtosidase Etwas aktiv: hellblau β-Galactosidase β -GalacXXXtosidase Aktiv: blau Inaktiv: weiß

Transformation +   Transformation E. coli Wachstum auf LB-AXI ? - - blau weiß

Insert-Analyse spezifisch universell blau weiß blau weiß

DNA-Sequenzierung DNA-Polymerase Sanger-Methode Next Generation Detektion Next Generation

PCR vs. Sequencing Reagenzien PCR DNA-Matrize dNTP (A,C,G,T) Primer forward Primer reverse PCR-Puffer Taq-Polymerase Reagenzien Sequencing DNA-Matrize dNTP (A,C,G,T) ddNTP ein Primer Sequencing-Puffer mod. Taq-Polymerase Zwei Matrizenstränge Exponentielle Zunahme Produkt mit bestimmter Größe dsDNA Ein Matrizenstrang Lineare Zunahme Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA

Didesoxynukleotide Aciclovir http://www.zct-berlin.de/struktur/nukleoside.html

Polyacrlyamidgelelektrophorese Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA PAGE: Trennung nach Größe mit hoher Auflösung!

DNA-Polymerase Domänen 5‘-3‘ Exonuklease 3‘-5‘ Exonuklease 5‘-3‘ Polymerase E. coli Pol I 928 As

DNA-Polymerase Herausschneiden von ddNTPs http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc461/GRAPHICS/Chapter27/Slide37.JPG

Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc461/GRAPHICS/Chapter27/Slide39.JPG Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA Produkte unterschiedlicher Größe ssDNA Verkürzen von Fragmenten früherer Zyklen

DNA-Polymerase Domänen 5‘-3‘ Exonuklease 3‘-5‘ Exonuklease 5‘-3‘ Polymerase E. coli Pol I 928 As  dNTP Bindetasche Taq Pol 832 As   Thermo Sequenase 560 As F667Y  Erleichterter Einbau ddNTPs Tabor & Richardson (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (92), 6339-6343

DNA-Polymerase Taq-DNA-Polymerase... ...modifiziert Ohne 3‘-5‘ Exonuklease Ohne 5‘-3‘ Exonuklease Mod. dNTP Bindetasche Keine „Reparatur“ der ddNTP Keine unerwünschten Fragment- längen Verringerte ddNTP Diskriminierung

Detektion... ... ist ein Problem, weil ausgehend von nur einem Primer nur lineare Amplifikation möglich!  geringe Produktmengen

Detektion - radioaktiv Radioaktive Markierung von dATP 33P, 32P 35S

Detektion - Floureszenz Fluoreszenz Markierung Fam (494nm, 517nm) Hex (535nm, 553nm) Rox (587nm, 607nm)

Detektion – Markierung Welche Moleküle können markiert werden? Primer am 5‘-Ende dNTPs ddNTPs ddNTPs mit vier verschiedenen Farben (Fluoreszenz)

http://www. mcb. uct. ac. za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033 http://www.mcb.uct.ac.za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033.htm

http://www. mcb. uct. ac. za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033 http://www.mcb.uct.ac.za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033.htm

http://www. mcb. uct. ac. za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033 http://www.mcb.uct.ac.za/principles%20of%20DNA%20sequencing/sld033.htm

pDrive Klonierungsstelle Orientierung: Spez. Primer f oder r?

Next Generation Sequencing Jay Shendure & Hanlee Ji (2008) Next-generation DNA sequencing, Nature Biotechnology 26 (10), 1135-1145 Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods, Annual Review of Genomics and Human Genetics 9:387–402

Denaturieren + Annealing Elongation Bridge PCR

Emulsion PCR

454 Platform Pyrosequencing http://www.454.com/products-solutions/how-it-works/sequencing-chemistry.asp

APS = Adenosinphosphosulfat http://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspx?id=8726 Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing. Lab Invest 2001, 81:673–679

Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing Gharizadeh, B. et al. Typing of Human Papillomavirus by Pyrosequencing. Lab Invest 2001, 81:673–679

Fertiges Genom als Gerüst! Assembly schwierig Hohe Fehlerrate Assembly einfach Geringe Fehlerrate Fertiges Genom als Gerüst! De Novo Sequenzierung Sanger cloning Polymerase ~$4000 $200,000 800 bp

Take Home Sanger: Kettenabbruch Polymerase: modifiziert Detektion: Fluoreszenz Next Generation: Genome